本方案提供了一种可重复的方法，通过附加体质粒电穿孔技术，从原代羊水细胞中生成无整合的非整倍体人类诱导多能干细胞。该方法优化了递送和培养条件，以稳定染色体异常，为下游研究和临床应用提供了一个实用的疾病特异性模型构建平台。
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本方案提供了一种可重复的方法，通过附加体质粒电穿孔技术，从原代羊水细胞中生成无整合的非整倍体人类诱导多能干细胞。该方法优化了递送和培养条件，以稳定染色体异常，为下游研究和临床应用提供了一个实用的疾病特异性模型构建平台。
从携带特定染色体非整倍性的羊水细胞（AFCs）中生成患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）为遗传性疾病建模提供了强大的平台。然而，由于这些细胞固有的基因组不稳定性和增殖能力差异，建立针对非整倍性AFCs的可靠且可重复的重编程流程在技术上仍具挑战性。本文介绍一种利用附加体型质粒电穿孔技术，从原代AFCs非整合性生成非整倍性人iPSCs的全面方法。本方案详细描述了完整的操作流程，包括细胞复苏与扩增过程中的逐步培养基适应策略、优化的质粒递送 通过 电穿孔系统、基于间充质-上皮转化（MET）方向性培养基更换的连续电穿孔后培养，以及根据明确定义的形态学标准进行的机械性克隆挑选。我们进一步描述了验证流程，包括核心多能性标志物的免疫荧光染色、G显带核型分析以确认非整倍体核型的维持，以及基于PCR的附加体质粒载体清除验证。该无饲养层、无整合的方案可获得适用于疾病建模、药物筛选及染色体生物学研究的非整倍体iPSC细胞系。
诱导性多能干细胞技术的出现，通过生成患者特异性的多能细胞而无需涉及人类胚胎干细胞（hESCs）相关的伦理问题，彻底改变了再生医学、疾病建模和药物发现领域。细胞重编程的概念基础源于Gurdon对体细胞核移植的证明1，随后是胚胎干细胞的建立2,3,4，最终发展为通过异位表达OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC实现诱导多能性5 。自此以后，iPSC技术已成为研究人类发育、遗传性疾病和精准医学不可或缺的平台。早期的重编程方法使用逆转录病毒或慢病毒载体，但其整合相关的风险限制了临床应用。因此，开发非整合型重编程方法成为临床转化的优先方向。这些方法包括使用仙台病毒6、合成mRNA7、基于oriP/EBNA1（Epstein-Barr核抗原-1）机制的附加体型载体8，以及仅使用小分子化合物的化学重编程9,10,11,....
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所有涉及人羊水样本的操作均遵循《赫尔辛基宣言》进行，并经北京大学第三医院机构审查委员会（IRB）/人类研究伦理委员会批准（方案编号：M2023406）。非整倍体样本来源于北京大学第三医院生殖医学中心生物样本库，该样本库为国家认证的临床资源库，专注于人类发育与生殖资源的保存。这些标本为常规羊膜腔穿刺术用于临床产前诊断时采集的剩余羊水，若无研究用途将被废弃。所有供体在样本采集前均签署了书面知情同意书，明确授权将剩余样本存入生物样本库并用于后续科学研究。所有样本均严格匿名化处理，以保护患者隐私。选取经临床G显带分析确认具有非整倍体核型的样本用于诱导多能干细胞（iPSCs）的建立，包括21三体（唐氏综合征，N = 2）、18三体（爱德华氏综合征，N = 1）、X单体（特纳综合征，N = 1）和克兰费尔特综合征（N = 2）。用于重编程的非整倍体细胞系的详细信息汇总于表1中。
1. 生物库保存的羊水细胞的解冻与原代培养
注意：本节详细说明了从生物样本库中获取和复苏非整倍体 AFC 的标准化流程。培养的细胞将被扩增，以获得足够数量的细胞群体，用于后续的附加体质粒重编程。
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重编程过程中的形态学进展
原代羊水细胞表现出异质性形态，包括E型和F型细胞（图1A）。应扩增并使用F型细胞进行重编程。将羊水细胞（AFCs）用电穿孔法转染Epi5附加体质粒后，可观察到一系列特征性的形态学变化。第0天时，AFCs呈现典型的梭形、成纤维细胞样形态。到第3–5天，出现重编程的最初形态学证据：在间充质细胞群体中出现小簇状上皮样细胞，标志着上皮-间质转化（MET）的开始。这些过渡态细胞比周围的间充质细胞更小、更致密。在第7–10天期间，细胞簇的致密程度进一步增加，反映出向典型上皮细胞形态的转变。完全重编程的诱导多能干细胞（iPSC）克隆在第14–16天开始出现。到第21–25天，成熟的iPSC克隆已可进行挑取（图1B）。为评估DNA递送效率，实验中同时电穿孔了pCE-GFP质粒与重编程质粒（图1C）。在早期培养过程中，GFP的表达可作为电穿孔成功及质粒持续存在的可视化指标。
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本方案描述了一种非整合、无饲养层的方法，利用附加体型质粒转染羊水细胞，以生成非整倍体人诱导多能干细胞 通过 电穿孔。重编程的成功取决于多个关键步骤。首先，起始的羊水细胞（AFC）群体质量至关重要。在临床细胞遗传学实验室中，AFC通常在旨在扩增的培养基中培养 以加速细胞增殖用于产前核型分析，而非长期培养。这种处理对后续诱导多能干细胞（iPSC）生成效率的影响尚不完全清楚。因此，在样本制备过程中应考虑培养基成分，并在解冻后富集低传代、高增殖能力的羊水细胞（AFC）群体，以确保电穿孔前的细胞质量最佳。其次，应优化电穿孔条件，在保证细胞存活率的前提下最大化DNA递送效率。在本方案中，采用1200 V、20 ms、2次脉冲的电穿孔参数 consistently 获得满意的转染效率和可重复的克隆形成效果。个别供体样本可能需要进行轻微的条件优化。电穿孔后前24–48小时内出现的过度细胞死亡，通常与起始细胞质量差、重悬于电穿孔缓冲液前未完全去除残留培养基或电穿孔过程中操作时间过长有关。第三，克隆挑取的时机至关重要：在第14天之前出现的克隆通常为部分重编程状态，而真正的iPSC克隆出现在第15至25天之间，具有典型的扁平、致密.......
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作者声明不存在任何竞争性财务利益。图7A中的示意图是使用人工智能辅助工具生成，随后由作者进行审阅和修改。
本工作得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2022YFA0913300）和北京大学第三医院临床重点项目（项目编号：BYSY2022054）对郭建英的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | 赛默飞世尔科技（吉比科） | 25200056 | 用于AFC传代的细胞解离 |
| 100bp Plus II DNA Ladder | TransGen Biotech | BM321-01 | DNA Ladder |
| -80 °C 冰箱 | 赛默飞世尔科技 | FDE60086fv | 质粒DNA与样本的长期保存 |
| Accutase 细胞解离液 | StemCell Technologies | 07920 | 轻柔地将iPSC解离成小细胞团 |
| 乙酸（冰醋酸） | Sigma-Aldrich | 338826 | 核型分析用固定液组分（甲醇:乙酸 3:1） |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | PCR产物的凝胶电泳（2%） |
| AmnioType-1 培养基 | VivaCell BIOSCIENCES | C3620-0100 | 初级AFC培养基 |
| 自动细胞计数器 / 血细胞计数板 | Countstar | TC20 | 台盼蓝排斥法活细胞计数 |
| 明场显微镜（100倍油镜） | 蔡司 | Axiovert5 | 用于核型分析的中期染色体铺展技术 |
| 离心机（摆桶转子） | Eppendorf | 5810R | 300 × g 条件下离心收集细胞 |
| II 级生物安全柜 | ESCO | AC2-4S8-CN | 所有细胞培养操作的无菌工作空间 |
| CO2 培养箱（带加湿功能） | 科学 | 3131 | 维持37°C、5% CO2环境 |
| 秋水仙胺（10 μg/mL） | Capricorn scientific | COL-H | 中期阻滞用于核型分析（0.1 μg/mL，2–4 小时） |
| CryoStor CS10 细胞冻存液 | STEMCELL Technologies | 07959 | 无细胞冷冻保存液 |
| DAPI | 默克密理博 | 10236276001 | 核染色 |
| DMEM（高糖） | 赛默飞世尔科技（吉比科） | 11965092 | 成纤维细胞培养基基础液 |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11330032 | Matrigel 稀释缓冲液（1:200） |
| 不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 DPBS | 赛默飞世尔科技（吉比科） | 14190250 | 洗涤缓冲液 |
| 附加体质粒（pCE-GFP） | Addgene | #41858 | 非整合型重编程载体（GFP对照） |
| 附加体质粒（pCXLE-hOCT3/4-shp53-F） | Addgene | #27077 | 非整合型重编程载体（OCT4 + shp53） |
| 附加体质粒（pCXLE-hSK） | Addgene | #27078 | 非整合型重编程载体（SOX2 + KLF4） |
| 附加体质粒（pCXLE-hUL） | Addgene | #27080 | 非整合型重编程载体（L-MYC + LIN28） |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30071.03 | 用于AFC扩增的血清添加剂（FC培养基，15%） |
| 荧光显微镜 | Leica | Sp8 | TRA-1-60/81 活细胞染色与免疫荧光成像 |
| 凝胶电泳系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 164-5056 | PCR产物的琼脂糖凝胶分析 |
| 明胶（0.1%） | Sigma-Aldrich | G1393 | 用于AFC贴壁的培养容器包被 |
| 基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | 4992199 | 从诱导多能干细胞中分离PCR级DNA |
| 吉姆萨染色液 | Sigma-Aldrich | GS500 | 染色体G显带染色（5%） |
| GlutaMAX（100倍浓缩液） | 赛默飞世尔科技（吉比科） | 35050061 | FC培养基补充剂 |
| 倒置相差显微镜 | Zeiss | Axiovert5 | 每日对培养物和菌落形态进行监测 |
| 液氮储存罐 | 赛默飞世尔科技 | CY50985 | 细胞的冷冻保存 |
| Matrigel 基底膜基质 | 康宁 | 354230 | 用于iPSC贴附的培养容器包被 |
| 甲醇（无水） | Sigma-Aldrich | 34860 | 核型分析用固定液组分（甲醇:乙酸 3:1） |
| NANOG 抗体（兔） | Abcam | ab109250 | 免疫荧光；核多能性标志物 |
| Neon NxT 电穿孔试剂盒（100 μL） | 赛默飞世尔科技（英杰） | N10025 | 电穿孔；包含缓冲液 R、T、E 以及 100 μL 吸头 |
| Neon NxT 电穿孔系统 | 赛默飞世尔科技（英坦科技） | NEON18S | 通过电穿孔递送附加体质粒 |
| 非必需氨基酸（NEAA，100倍浓缩液） | 赛默飞世尔科技（吉比科） | 11140050 | FC培养基补充剂 |
| OCT4 抗体（兔） | Abclonal | A7920 | 免疫荧光；细胞核多能性标志物 |
| 高保真 PCR 预混液 | TIANGEN | 4992920 | 通过PCR验证附加体清除 |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | #37624 | 非复制型附加体表达EBNA1 |
| PE 抗人 TRA-1-81 抗体 | BioLegend | 330708 | 多能性染色 |
| 青霉素-链霉素（100倍浓缩液） | 赛默飞世尔科技（吉比科） | 15140122 | 抗生素添加剂（电穿孔后不使用） |
| Phalloidin-iFluor 647 试剂 | Abcam | ab176759 | F-肌动蛋白（肌动蛋白丝）标记 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P5405 | 染色体核型分析用低渗溶液（0.075 M） |
| 实时荧光定量PCR系统 | 赛默飞世尔科技 | QuantStudio3 | 用于标志基因验证的qPCR |
| 丁酸钠 (NaB) | Sigma-Aldrich | B5887 | 组蛋白去乙酰化酶抑制剂；25-100 μM，用于增强重编程 |
| SOX2 抗体（小鼠） | R&D系统 | MAB2018 | 免疫荧光；细胞核多能性标志物 |
| SSEA-4 抗体 | BioLegend | 330408 | 免疫荧光；细胞表面多能性标志物 |
| 体视显微镜 | 尼康 | SMZ745 | 在放大条件下进行机械挑取菌落 |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | 05990 | 无饲养层iPSC维持培养基 |
| TRA-1-60 抗体 | 默克密理博 | MAB4360 | 多能性染色 |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | DNA Ladder |
| TransDetect PCR支原体检测试剂盒 | TransGen Biotech | FM311-01 | 支原体检测 |
| TrypLE Select 酶（1x） | 赛默飞世兰（吉比科） | 12563011 | 贴壁 AFCs 的轻柔细胞解离 |
| 胰蛋白酶（0.025%） | Sigma-Aldrich | T4799 | 载玻片G显带预处理（30-60秒） |
| VeritiPro 96孔热循环仪 | 赛默飞世尔科技 | A48141 | 用于游离体清除验证的PCR |
| 水浴锅（37 °C) | 上海智信实验仪器技术有限公司 | ZX-S22 | 解冻培养基和试剂 |
| Y-27632 二盐酸盐（ROCK抑制剂） | Tocris | 1254 | 提高iPSC解离后的存活率（10 uM） |
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