本方案提供了一种标准化且可重复的工作流程，用于评估人牙源性干细胞在纳米材料支架上培养后的增殖能力以及成骨和成牙本质分化潜能。该方法采用标准化检测手段（碱性磷酸酶活性、RANKL免疫荧光[成骨]和DMP-1免疫荧光[成牙本质]）及归一化策略，以确保不同研究之间的可比性。
本文内容
摘要
摘要
对成骨和成牙分化以及干细胞增殖能力的可靠评估，是评价基于支架的再生策略生物学性能的基础。然而，实验方案、检测方法选择及数据解读方面的差异，常常限制了研究结果的可重复性及不同研究间的比较。本文所述方案提供了一种标准化、可重复的工作流程，用于体外评估在生物材料支架上培养的干细胞的成骨与成牙分化能力以及增殖潜能。成骨分化通过碱性磷酸酶（ALP）酶活性和核因子κB受体激活因子配体（RANKL）免疫荧光进行评价；成牙分化则通过DMP-1（牙本质基质蛋白-1）免疫荧光进行评估；上述蛋白表达水平均采用标准化的H评分方法进行定量。本文详细描述了关键实验参数，包括细胞接种密度、诱导时间、检测条件、标准化策略（包括以蛋白含量归一化的ALP活性、以细胞数归一化的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）活力检测及免疫荧光H评分）以及数据分析方法，并提供了故障排除指导，以最大限度减少技术变异。该方法已作为标准化框架应用于多项基于支架的实验研究，展现出良好的稳健性和可重复性。通过提供一套全面且经过验证的评估体系，本文旨在促进干细胞-支架相互作用的标准化评价，并提高临床前再生医学研究之间的可比性。
引言
再生牙髓学代表了牙科领域的一场范式变革，其重点是利用干细胞、生长因子和支架来恢复牙髓活力1,2。维持牙髓活力对于牙齿的感觉功能和免疫反应至关重要，尤其在处理牙髓坏死的年轻恒牙时，有助于牙根的持续发育2。
人牙髓干细胞（DPSCs）和根尖乳头干细胞（SCAPs）是这些操作的主要候选细胞，因其具有高增殖潜能、自我更新能力、免疫抑制特性，并能在适宜的微环境条件下分化为成牙本质样细胞，使其成为再生医学和基于细胞的治疗干预未来应用中极具可行性的候选细胞3,5,5。
尽管传统配方材料（如硅酸钙类水泥）已被广泛研究，但新出现的证据表明，纳米颗粒改性可显著影响生物材料与细胞之间的相互作用6。纳米结构生物材料可能提供更接近生物体内的微环境，从而有望增强干细胞的黏附能力及谱系特异性分化7。然而，与已建立的材料（如纳米羟基磷灰石）相比，新型材料（如以纳米颗粒形式存在的NeoMTA2）的生物学行为仍缺乏充分理解8。本实验方案旨在建立一套标准化的方法学框架，以准确且可重复地评估这些相互作用。
该标准化框架特别适用于在相同生物条件下评估新型生物材料或纳米材料支架的研究，其中研究间的可比性至关重要。通过在一个工作流程中整合细胞活力筛选（MTT法）、早期成骨分化（ALP活性）和蛋白水平分化（免疫荧光H评分），该方法相较于单一检测方法具有优势。使用传统茜素红染色或单时间点检测的研究人员可采用这一多参数框架，以减少观察者偏差并提高定量分辨率。然而，本方案未经适当调整，不适用于三维类器官培养、共培养系统或动物来源的干细胞模型。对于需要进行基因表达谱分析（如RUNX2、OCN或DSPP的RT-qPCR）的研究人员，应补充分子检测手段，因为本方案仅聚焦于蛋白和酶学终点指标。
为了全面捕捉牙源性干细胞的双功能分化能力，本方案采用两种互补的免疫荧光标记物，以反映不同的生物学终点。RANKL（核因子κB受体活化因子配体）作为成骨细胞系分化的标志物：其在成骨样细胞上的表达反映了钙离子驱动的矿化信号传导及成骨细胞的活化，这与多项研究中评估SCAPs4,8,9时的使用一致；同时，DMP-1（牙本质基质蛋白-1）被并行用作牙源性/成牙本质分化特异性标志物：其在成牙本质样细胞中的上调表达反映了牙本质基质形成的诱导以及牙髓特异性硬组织修复过程，尤其在目标细胞群体为DPSCs时具有重要意义10。通过在同一实验体系中采用H评分法对RANKL和DMP-1进行定量分析，本方案使研究人员能够在无需设计独立实验的情况下，区分干细胞-支架相互作用所导致的成骨分化与牙源性分化——这两种结果存在重叠，但在机制上截然不同。
方案
本方案已获得艾因夏姆斯大学牙科学院伦理委员会批准，批准编号为 FDASU-Rec IM112105。所有涉及人体组织的操作均遵循《赫尔辛基宣言》的规定。在牙齿拔除和干细胞采集前，已从所有参与者处获得书面知情同意书。
1. 纳米材料的制备与表征
- 根据具体要求合成纳米材料10,11。对于Nano-NeoMTA2，使用行星式球磨机（见材料表）以350 rpm转速研磨10小时，采用3分钟开/3分钟关的间歇模式。研磨球与粉末的质量比为10:1，使用氧化锆研磨球（直径5 mm）和氧化锆研磨罐。在进入下一步前，通过透射电子显微镜（TEM）验证最终粒径（目标：<200 nm）。
警告： NeoMTA2粉末若被吸入可能引起呼吸道刺激。所有干法球磨操作均须在经认证的通风橱内进行，并佩戴N95呼吸器、安全护目镜和丁腈手套。 - 采用湿化学沉淀法制备纳米羟基磷灰石8,11,12：10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O。分别用去离子水配制1 L的0.5 M硝酸钙溶液和0.6 L的0.3 M磷酸铵溶液。在持续搅拌（400 rpm）下，以约2–3 mL/min的速度将硝酸钙溶液滴加至磷酸铵溶液中，并加热至70 °C，同时通过逐滴加入氨水维持pH值在10–12之间8。
警告： 氨水具有腐蚀性，并释放有毒氨蒸气。仅可在化学通风橱内操作。佩戴耐酸手套、防溅护目镜和实验服。皮肤接触后应立即用清水冲洗≥15分钟。 - 将所得的磷灰石沉淀在高压釜中进行水热处理，条件为140 °C、0.3 MPa，持续2–3小时10。将纯化后的沉淀物在真空度≤0.05 mbar、温度-50 °C条件下冷冻干燥48小时8。
- 采用溶胶-凝胶法制备生物活性玻璃45S5纳米颗粒，步骤如下：
- 在聚丙烯烧杯中，于室温下以300 rpm持续搅拌，将40 mL正硅酸乙酯（TEOS）与10 mL 2 M硝酸（HNO₃）混合，后者作为酸催化剂，制备前驱体溶液。
- 30分钟后，加入四水合硝酸钙（Ca(NO₃)₂·4H₂O）和硝酸钠（NaNO₃），以达到目标摩尔组成：45 mol% SiO₂、24.5 mol% CaO、24.5 mol% Na₂O和6 mol% P₂O₅。加入三乙基磷酸酯（TEP）作为磷源。
- 室温下持续搅拌24小时。将凝胶在密封容器中于60 °C老化24小时。在120 °C下干燥24小时。在马弗炉中以650 °C煅烧3小时（升温速率：2 °C/min）。研磨后通过透射电子显微镜（TEM）和X射线衍射（XRD）确认物相组成4,9。
警告： TEOS和乙醇易燃。HNO₃具有腐蚀性。所有操作均须在远离点火源的通风橱内进行。
- 使用高分辨率透射电子显微镜（TEM）和X射线衍射（XRD）对所有制备的纳米颗粒进行表征，以确认粒径和结晶度8。采用动态光散射（DLS）测定平均粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位，以评估胶体稳定性。接受平均粒径<200 nm且Zeta电位<−15 mV或>+15 mV的批次。
2. 干细胞的获取与培养
- 在获得书面知情同意后，从新拔除的下颌阻生第三磨牙中获取牙髓干细胞（DPSCs）或根尖牙乳头干细胞（SCAPs）10。拔除的牙齿需在2小时内进行处理，并在4 °C条件下用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）运输。
注：供体纳入标准包括18–35岁全身健康的成年人，非吸烟者，近3个月内未使用过抗生素，无牙周病史，且影像学检查无根尖周病变证据。 - 采用酶消化法分离细胞9。将牙源组织剪碎成1–2 mm大小的组织块，加入浓度为3 mg/mL的I型胶原酶溶液，在无血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中于37 °C持续振荡消化1小时（摇床转速为60 rpm）8。用完全培养基中和反应，经70 µm细胞筛过滤。
注意：I型胶原酶可能含有内毒素。仅可使用经内毒素检测合格、适用于组织培养级别的胶原酶。操作时应佩戴手套，避免吸入。 - 将单细胞悬液以初始密度为1 × 104 个细胞/cm2 接种于75 cm2 培养瓶中，培养基为含DMEM、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的完全培养基（材料表）8。
- 将培养瓶置于37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育8。每日使用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及是否存在污染10。每48–72小时更换一次培养基。若发现污染迹象（培养基浑浊、颜色改变、细胞形态异常），则弃用该培养瓶。
- 在第三次传代后收获细胞，此时细胞融合度约为70–80%8。传代时，吸除培养基，用PBS冲洗，再加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液于37 °C消化3–5分钟使细胞脱落。加入完全培养基中和，300 x g 离心5分钟，重悬后以1 × 104 个细胞/cm2 的密度重新接种。为保持表型稳定性，仅使用第3至第6代之间的细胞。
3. 干细胞鉴定
- 使用流式细胞术评估分离细胞的免疫表型8,10。在第三代细胞中进行表征。包括未染色的阴性对照以及每种荧光染料对应的单染补偿对照。
- 将细胞浓度调整至106/mL（PBS缓冲液）。以800 × g 离心10分钟，并用PBS洗涤沉淀两次8,10。
- 按照制造商推荐的稀释比例（通常为1:100，溶于含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中）使用抗人抗体对间充质标志物（CD44、CD43）和造血标志物（CD45）进行染色（材料表）8,10。4 °C避光孵育45分钟。用PBS洗涤两次后，重悬于300 µL PBS中用于上机检测。
- 使用流式细胞术分析软件（材料表）分析细胞，评估其免疫表型（CD44和CD73的表达，CD45作为造血系排除标志物）。采用逐步设门策略：(a) 散射光设门（FSC-A vs. SSC-A）；(b) 双联体排除（FSC-H vs. FSC-A）；(c) 根据未染色对照设定各荧光染料特异性门控。报告每种标志物阳性细胞百分比，并说明设门策略。
4. 安全材料浓度的测定（半最大有效浓度，EC₅₀）
- 确定 EC₅₀ 使用统计分析软件（GraphPad Prism 9）将剂量-反应数据拟合至非线性回归S型曲线（四参数逻辑模型：Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). 报告 EC₅₀ 值在 µg/mL 95% 置信区间8.
- 制备纳米材料的系列稀释液（50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 和 1.56 µg/mL) 加入1 mL PBS中。将储备悬液涡旋振荡30秒，然后进行超声处理（探头式超声仪，40 W，开启30秒/关闭10秒，重复3个循环，于 4 °C）以确保形成均一的悬浮液。在生物安全柜中，于紫外灯下紫外灭菌30分钟。
- 以1的密度培养干细胞 × 104 在96孔板中以不同浓度处理细胞，每孔细胞数/孔，培养72小时，使用台盼蓝计数活细胞以计算EC₅₀ 使用第4.1步中所述的四参数逻辑模型。
- 以至少三个生物学重复进行实验，每个浓度设置三个复孔（n = 3个独立孔）。报告EC₅₀ 均值 ± 标准差（SD）并计算重复样本间的变异系数（CV%）（可接受的 CV <15%).
5. 成骨与成牙向分化能力的评估
注意：本部分使用来自同一批细胞样本的平行免疫荧光检测，评估两种互补的分化途径。RANKL（步骤 5.5）作为成骨标志物；DMP-1（步骤 5.6）作为成牙本质标志物。两者均采用相同的 H 值评分方法（步骤 5.8）进行定量。应在同时制备的独立盖玻片上分别进行两项检测。
- 以 4.5 的密度将种子干细胞接种于六孔板中 × 105 细胞/孔。在完全培养基中培养24小时，使细胞贴壁，然后开始诱导分化。
- 将样本分为四组：阴性对照组（仅DMEM）、阳性对照组（成骨/成牙本质分化培养基）和实验组（EC浓度的纳米材料）₅₀-衍生的安全浓度）。
- 通过在DMEM中添加10% FBS、1%青霉素/链霉素和10 mM β-甘油磷酸盐， 50 µg/mL 抗坏血酸（L-抗坏血酸-2-磷酸）、100 nM 地塞米松。每48小时更换一次培养基。在37℃下孵育72小时 37 °C 和5% CO₂₂.
- 碱性磷酸酶活性测定
- 在24孔培养板中接种细胞 × 104 细胞/孔，在37℃下孵育 37 °C 在含5% CO₂的湿润环境中₂ 72 小时。
- 吸弃培养基，用 PBS 洗涤孔板，加入裂解液裂解细胞 200 µL 每孔加入裂解缓冲液（PBS 中含 0.1% Triton X-100），并于 4 °C 轻轻摇动10分钟。
- 收集裂解液，在500 x g条件下离心 g 5 分钟 4 °C；将上清液用于后续所有的碱性磷酸酶（ALP）检测。转移 50 µL 每个测试样品的 100 µL 将对硝基苯酚标准品加入96孔微孔板中。加入AMP底物缓冲液（材料清单以启动催化反应。
- 30分钟的二次孵育后 37 °C，通过加入终止反应 50 µL 每孔加入 0.5 M NaOH。使用吸光度酶标仪立即在 405 nm 处测定吸光度（材料表).
- 绘制吸光度与对硝基苯酚浓度的标准曲线，并计算碱性磷酸酶（ALP）活性，单位为 U/L。
- 使用 Bradford 或 BCA 蛋白质测定法测定相同细胞裂解液的总蛋白含量。将碱性磷酸酶（ALP）活性归一化为总蛋白含量，并以 U/mg 蛋白表示最终结果。
- 成骨标志物（RANKL）
- 使用免疫荧光法检测RANKL蛋白表达。首先，制备同型对照和仅二抗对照：（a）在部分孔中用同型匹配的兔IgG替代一抗，浓度保持相同；（b）在另设的孔中完全省略一抗。
- 用新鲜配制的4%多聚甲醛PBS溶液在室温下固定细胞15分钟。用PBS洗涤三次，每次5分钟。
- 用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 处理 10 分钟以实现通透化，随后在室温下用含 5% 正常山羊血清的 PBS 封闭 1 小时，以减少非特异性结合。无需洗涤，直接在封闭缓冲液中加入兔抗 RANKL 一抗，稀释比例为 1:200材料表）并在过夜孵育 4 °C.
- 用 PBS 洗涤三次，然后在封闭缓冲液中加入羊抗兔 IgG 荧光标记二抗，按 1:500 稀释后孵育（材料表在室温避光条件下孵育1小时8二抗孵育后，用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟，随后直接进行步骤 5.7 的封片操作。
注意： 甲醛（4% 溶液）为有毒固定剂，且可能具有致癌性。仅可在经认证的化学通风橱中配制和使用。操作时需佩戴腈类手套、防溅护目镜及实验服。废弃物应按照机构规定进行处置。
注意：细胞身份的确认是在免疫荧光评分之前，通过相差显微镜和形态学标准进行的（见步骤5.10）。
- 成牙本质细胞标记物（DMP-1）
注意：在进行第5.5步的同时，采用免疫荧光法平行检测DMP-1（dentin matrix protein-1）蛋白表达，以评估成牙本质分化潜能。- 使用同一细胞制备的另一组盖玻片，重复步骤5.5中所述的所有固定、通透和封闭步骤，包括同型对照和仅二抗对照。
- 封闭后无需洗涤，直接加入抗DMP-1一抗（参见 材料表) 按1:200稀释比例加入封闭缓冲液中，4℃孵育过夜 4 °C用PBS洗涤三次，然后加入相应的荧光染料标记的二抗（所用荧光染料的光谱需与RANKL所用的不同；参见 材料表在避光条件下，用封闭缓冲液按1:500稀释比例室温孵育1小时。
- 以10倍放大倍数采集荧光图像，以评估DMP-1表达作为成牙本质样细胞分化的指标10二抗孵育后，用PBS洗涤三次，每次5分钟，随后直接进行步骤5.7的封片操作。
- 使用抗荧光淬灭封片剂封片（参见 材料表）并在室温下静置过夜。分别封片固定RANKL和DMP-1染色的切片，并清晰标记（例如， "RANKL 第1组" 和 "DMP-1 第1组"成像前
- 立即通过荧光显微镜检查载玻片，或储存于 4 °C 避光保存。通过标准化的四级评分系统评估染色强度，以定量蛋白质表达水平：0分（无染色）、1+（弱染色）、2+（中等染色）和3+（强染色）。
- 使用相同的显微镜设置（曝光时间、激光功率和增益）对所有实验组进行成像。针对每个标记物（RANKL 和 DMP-1）分别应用相同的设置，以确保各组间同一标记物的一致性。
- 每孔随机选取不少于五个高倍视野（20倍物镜）进行评分。由两名独立的盲法观察者完成评分，并报告Cohen's kappa系数（可接受的kappa值 ≥ 0.7）。
- 使用以下公式计算 H 值：H 值 = Σ(i × Pi），其中 i 代表染色强度（1、2 或 3），Pi = 每个强度水平下的细胞百分比（0–100%）。
注：H 评分范围为 0 至 30010. - 将H评分数据根据每个视野的总细胞数进行归一化处理，总细胞数通过在免疫荧光成像前于相差显微镜下手动计数每个视野中所有可见细胞获得，以校正不同孔之间细胞密度的差异。
- 分别计算并报告RANKL（成骨终点）和DMP-1（成牙本质终点）的H评分，以实现两种分化途径之间的直接比较。
6. 增殖与活力评估
- 使用血细胞计数板和台盼蓝染色进行细胞计数，以区分活细胞与非活细胞。计算每毫升培养液中活细胞的总数。每个样本至少计数100个细胞，以确保统计可靠性。
- 采用 MTT 法检测线粒体代谢活性8,10.
- 加入 MTT 溶液至终浓度为 0.5 mg/mL（材料表) 加入细胞，于 4 h 孵育 37 °C. 去除溶液，加入溶解剂（如 SDS-HCl；参见 材料表），并在分光光度计上测定570 nm处的光密度（参考波长：630–650 nm）。
- 计算细胞活力：活力 (%) = （处理组细胞吸光度 / 未处理对照组细胞吸光度） × 100. 数值 >100% 表示相对于阴性对照的增殖刺激。应设置空白孔用于背景校正。
- 使用平行的台盼蓝计数法对细胞数量进行归一化处理。所有实验均设三个复孔（每组 n = 3 孔，≥3 次生物学重复）。
警告： SDS-HCl 溶解缓冲液具有腐蚀性。操作时应穿戴适当的个人防护装备。含甲臜的废弃物应按照机构规定进行处理。
结果
本文所示所有结果均改编自同一研究团队在统一机构伦理批准（FDASU-Rec IM112105）下开展的配套研究4,8,9,10。
纳米材料表征与干细胞分离
标准化流程首先可定量确认支架特性和干细胞表型。合成后，采用高分辨率透射电子显微镜（TEM）和X射线衍射（XRD）对制备的纳米材料进行验证，以确认颗粒尺寸和结晶度（图1A、B）。同时，通过酶消化法分离的牙髓干细胞（DPSCs）或根尖乳头干细胞（SCAPs）在完全培养基中表现出良好的贴壁能力和增殖活性。流式细胞术分析验证了第3代收获细胞的免疫表型，结果显示间充质标志物（CD44、CD43）高表达，并通过CD45阴性表达确认其非造血来源（图1C）。
安全材料浓度的确定与细胞增殖
通过在纳米材料的系列稀释浓度（50–1.56 µg/mL）培养72小时后，对活细胞数量进行四参数逻辑回归分析可得到可靠的EC₅₀ 值（非线性S形剂量-反应模型，如步骤4.1所述）。MTT活力值超过100%表示相对于未处理对照组具有增殖刺激作用，因为数据已归一化至阴性对照组（未处理细胞设为100%）。例如，Nano-NeoMTA2的值约为196%，反映的是线粒体活性的生物刺激作用，而非 >100% 绝对细胞存活率9.
在多项采用该标准化方案的研究中，使用四参数逻辑模型（步骤4.1）测得EC₅₀值分别为7.9 µg/mL（Nano-NeoMTA2，SCAPs）8和9.92 µg/mL（Nano-NeoMTA2，DPSCs）10，证实了本方案所述分化实验中的安全工作浓度。这些数值已作为代表性验证指标纳入表1。
成骨与成牙本质分化定量分析（双标记评估）
双重免疫荧光方法可从同一批细胞样本中获得两个不同且互补的结果指标。在成骨评估中，RANKL H评分在全部四组之间均表现出统计学显著差异：与阴性对照组相比，经Nano-NeoMTA2培养的细胞显示出显著更高的RANKL表达水平，表明成骨细胞样活性上调图2A，表1)8,9在牙源性评估中，DMP-1 H评分显示，使用Nano-NeoMTA2培养的DPSCs表现出显著的成牙本质样细胞分化，其H评分显著高于纳米羟基磷灰石组和阴性对照组，证实了其对牙本质生成分化的优先诱导作用 (图3A，表1）10在计数前，通过相差显微镜观察细胞形态特征（如纺锤形或多边形形态）以确认细胞身份。
在405 nm波长下，通过分光光度法检测各组的碱性磷酸酶（ALP）活性，该酶可作为成骨和成牙分化早期的酶学标志物（表1）。分光光度法MTT分析证实，所有纳米材料在基于EC₅₀确定的安全浓度下，细胞活力均保持较高水平，与阴性对照组相比结果一致，符合所列的代表性数值（表1）。
次优及失败的实验结果
次优结果总结见表2。MTT实验中细胞活力偏低通常表明纳米材料浓度超过了EC₅₀阈值，或UV灭菌不充分。ALP吸光度结果不一致（变异系数CV > 20%）通常提示细胞接种密度不均或裂解缓冲液未充分均质化。RANKL或DMP-1的免疫荧光信号弱或缺失，最常见原因为抗体失活、通透化不足或过度固定；使用新鲜配制的4%甲醛和一次性分装抗体可解决此问题。在判读结果前，应通过检查仅加二抗的对照图像排除RANKL与DMP-1通道间的交叉反应。
图1纳米材料的标准化表征及干细胞表型的验证 (AXRD 谱图证实了纳米颗粒的晶相和结构完整性。B) 透射电子显微镜（TEM）代表性图像，展示所合成生物材料的纳米级粒径、形貌及均匀分散性，并对 NeoMTA2 与羟基磷灰石进行比较。（a）NeoMTA2 和（b）羟基磷灰石的低倍图像，（c）NeoMTA2 和（d）羟基磷灰石的高倍图像。比例尺位于图像左下角。C流式细胞术门控方案用于干细胞表征。代表性多参数散点图显示了经CD44、CD73（原始图中标记为CD43 PE）和CD45染色的细胞。CD44+ 和 CD73+ 亚群的门控基于CD45表达情况。图A和图C改编自Zaki等人的研究。8 （CC BY-NC-SA） 以及图B改编自Habib等人10 （知识共享署名-非商业性使用） 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2通过RANKL免疫荧光对成骨分化进行定量与半定量评估 (A代表性高分辨率免疫荧光显微图像，展示了二维支架微环境中关键成骨蛋白标志物RANKL的表达情况。（a）阴性对照细胞形成小的克隆集落，RANKL表达微弱且局限于细胞膜；而（b）阳性对照细胞则显示出更多成骨样细胞集落，RANKL表达密集且均一。（c）经NHAP、（d）NHAP/壳聚糖及（e）生物活性玻璃纳米颗粒处理的干细胞表现出更显著的分化特征，表现为大而融合的成骨样细胞集落，RANKL在细胞膜和细胞核中均呈现强而均一的定位；改编自： Elshahat 等4. (B) 不同研究中RANKL表达H评分定量的柱状图。H评分方法在免疫荧光数据标准化中的应用。通过将显微观察的染色强度（分为0–3级）与阳性染色细胞百分比进行数学整合，H评分将定性显微结果转化为可靠且半定量的指标，显著降低了观察者的主观偏差。（a）Nano-NeoMTA2的比较（7.9 µg/mL）和生物活性玻璃纳米颗粒（NBG； 500 µg/mL) 与成骨培养基阳性对照（OM-PC）和DMEM阴性对照（DMEM-NC）相比。NBG诱导出最高的表达谱（p &< 0.001）。改编自 Abdelaziz 等人9（CC BY-NC-ND 4.0）。（b）纳米羟基磷灰石（NHAP； 10µg/mL），NHAP/壳聚糖复合材料（10 µg/mL），以及NBG（500 µg/mL) 相较于对照组，NHAP/壳聚糖组显示出最高的H评分。改编自 Elshahat 等人。4 （CC BY 4.0）。（c）Nano-NeoMTA2的评估7.9 µg/mL）与NHAP相比（10 µg/mL）和对照组相比，显示出在Nano-NeoMT中RANKL表达显著升高，改编自：Zaki等8. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：代表性免疫荧光图像及H评分分析。（A）实验各组中牙本质基质蛋白（DMP-1）表达的免疫荧光显微镜评估 ；绿色荧光表示多克隆抗DMP-1抗体的阳性染色。（a）阴性对照：未分化培养基（UM）中的人牙髓干细胞（hDPSCs）显示少量细胞聚集体，DMP-1表达微弱且均匀（+）。（b）阳性对照：成牙本质诱导培养基（OM）中的hDPSCs形成扩增的细胞克隆，呈现密集且均一的DMP-1信号（++）。（c）纳米羟基磷灰石（10 μg/mL）和（d）Nano-NeoMTA2（9.92 μg/mL）：分化的hDPSCs形成大而融合的类成牙本质细胞克隆，DMP-1在细胞膜和细胞核区域呈现强而均一的表达。放大倍数：×10。黄色圆圈标示类成牙本质细胞克隆；黄色箭头指示强烈的DMP-1表达。（B）各研究组牙本质基质蛋白表达的H评分定量柱状图。各评估组之间存在极显著差异，其中Nano-NeoMTA2组的H评分最高（169.33 ± 4.04），其次为纳米羟基磷灰石组（140.33 ± 2.52），阴性对照组最低（15.33 ± 1.53）。图A和图B改编自Habib等10 （CC BY-NC）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 检测/参数 | 纳米材料/细胞类型 | 代表性数值（均值 ± 标准差） | 标准化方法 | 来源 |
| 细胞活力（MTT 检测） | ||||
| MTT 细胞活力 | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1.56 ± 0.24) | 以未处理对照组为基准进行标准化 (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| MTT 细胞活力 | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99.97% | 以未处理对照组为基准进行标准化 (DMEM-NC = 100%) | Elshahat et al.⁴ |
| MTT 细胞活力 — 阳性对照 | OM-PC / SCAPs | 113.46% (OD = 0.93 ± 0.03) | 以未处理对照组为基准进行标准化 (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| MTT 细胞活力 — 阴性对照 | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0.82 ± 0.02) — 参考基线 | DMEM-NC 定义为所有组别的 100% 参考值 | Abdelaziz et al.⁹ |
| 碱性磷酸酶（ALP）活性 | ||||
| ALP 活性 | 生物活性玻璃纳米颗粒 (500 µg/mL) / SCAPs | 69.86 ± 0.98 U/L | 以总蛋白含量为基准进行标准化 (U/mg 蛋白，Bradford/BCA 检测) | Abdelaziz et al.⁹ |
| ALP 活性 — 阳性对照 | OM-PC / SCAPs | 77.68 ± 1.28 U/L | 以总蛋白含量为基准进行标准化 (U/mg 蛋白，Bradford/BCA 检测) | Abdelaziz et al.⁹ |
| ALP 活性 — 阴性对照 | DMEM-NC / SCAPs | 55.81 ± 1.6 U/L | 以总蛋白含量为基准进行标准化 (U/mg 蛋白，Bradford/BCA 检测) | Abdelaziz et al.⁹ |
| 安全材料浓度（EC₅₀） | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7.9 µg/mL | 四参数逻辑模型 （非线性S形剂量-反应曲线， GraphPad Prism 9） | Zaki et al.⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9.92 µg/mL | 四参数逻辑模型 （非线性S形剂量-反应曲线， GraphPad Prism 9） | Habib et al.10 |
| H-评分 — RANKL 蛋白表达（成骨标志物） | ||||
| H-评分 (RANKL) 成骨标志物 | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (评分范围 0–300) | 每视野可见细胞总数 （相差显微镜） | Zaki et al.⁸ |
| H-评分 (RANKL) 成骨标志物 | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (评分范围 0–300) | 每视野可见细胞总数 （相差显微镜） | Zaki et al.⁸ |
| H-评分 (RANKL) 阳性对照 | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (评分范围 0–300) | 每视野可见细胞总数 （相差显微镜） | Zaki et al.⁸ |
| H-评分 (RANKL) 阴性对照 | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (评分范围 0–300) | 每视野可见细胞总数 （相差显微镜） | Zaki et al.⁸ |
| H-评分 — DMP-1 蛋白表达（牙源性标志物） | ||||
| H-评分 (DMP-1) 牙源性标志物 | Nano-NeoMTA2 (9.92 µg/mL) / DPSCs | 169.33 ± 4.04 (评分范围 0–300) | 每视野可见细胞总数 （相差显微镜） | Habib et al.10 |
| H-评分 (DMP-1) 牙源性标志物 | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140.33 ± 2.52 (评分范围 0–300) | 每视野可见细胞总数 （相差显微镜） | Habib et al.10 |
| H-评分 (DMP-1) 阴性对照 | DMEM-NC / DPSCs | 15.33 ± 1.53 (评分范围 0–300) | 每视野可见细胞总数 （相差显微镜） | Habib et al.10 |
| H-评分 (DMP-1) 牙源性标志物 [阳性对照 -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 H-评分 (评分范围 0–300) | 每视野细胞总数 （相差显微镜） | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| H-评分 = Σ(i × Pi)：i = 染色强度（1、2 或 3）；Pi = 各强度水平下的细胞百分比（0–100%）；评分范围 0–300。 MTT 细胞活力以 DMEM-NC 为 100% 参考值进行相对表达。 ALP 活性以对硝基苯基磷酸盐酶促去磷酸化反应测定，单位为 U/L；进一步以总蛋白含量标准化（U/mg 蛋白）。 OM-PC = 成骨/牙源性诱导培养基（阳性对照）。 DMEM-NC = 达尔伯克改良伊格尔培养基（阴性对照）。 | ||||
表1：标准化体外评估工作流程的代表性结果。 来自先前已发表研究的代表性定量结果，展示了使用标准化方案进行的细胞增殖、碱性磷酸酶活性及免疫荧光分析。
| 观察到的问题 | 可能原因 | 推荐溶液 |
| MTT实验中细胞活力低 （OD < 未处理对照组 | 纳米材料浓度超过EC₅₀，或紫外线灭菌不充分，或纳米颗粒分散不充分。 | 重新运行 EC₅₀ 测定（第4节）。将紫外灭菌时间延长至30分钟。通过探头式超声处理验证纳米颗粒悬浮液的均匀性（40 W，开启30秒/关闭30秒，重复3个循环） 4 °C使用前立即准备。 |
| MTT 活性 CV >15% 的重复间差异 | 移液误差、细胞接种不均或 MTT 孵育时间/温度不一致。 | 使用校准的多通道移液器进行所有加样操作。铺板前通过血细胞计数板确认接种密度。严格孵育4小时 37 °C 在湿润的CO₂环境中₂ 培养箱。设置一个空白孔用于背景校正。 |
| ALP 吸光度读数不一致（CV >20% 跨孔差异 | 细胞接种密度不均、细胞裂解不完全，或在添加底物过程中移液操作不一致。 | 严格遵守 1 × 10⁴ 24 孔板中每孔细胞数。使用前充分涡旋振荡裂解缓冲液。保持一致的裂解孵育条件（10 分钟， 4 °C，轻柔振荡）。使用无细胞空白孔检测背景吸光度。 |
| RANKL 免疫荧光弱或缺失 信号（步骤 5.4a） | 抗体因储存不当而失活、过度固定导致表位可及性降低，或通透不充分。 | 使用前立即配制新鲜的4%甲醛。封闭前进行0.1% Triton X-100透化处理（10分钟，室温）。梯度稀释一抗（起始稀释度为1:200）。设置阳性对照组织切片。分装抗体储备液，避免反复冻融。 |
| DMP-1 免疫荧光弱或缺失 信号（步骤 5.4b） | 抗体失活，原因可能包括冻融循环、一抗稀释比例不适宜或二抗宿主物种不匹配。 | 分装抗DMP-1抗体以避免冻融循环。从1:200稀释度开始进行滴定。确认一抗（DMP-1）与二抗之间的宿主物种兼容性。使用牙本质组织切片作为DMP-1的阳性对照。 |
| RANKL 与 DMP-1 之间的交叉反应性 荧光通道 | 两种二抗使用了相同荧光染料导致发射光谱重叠，或荧光显微镜的通道分离不充分。 | 使用光谱不同的荧光染料标记的二抗分别检测 RANKL 和 DMP-1（例如，一种标志物使用 Alexa Fluor 488，另一种使用 Alexa Fluor 594）。在评分前，应独立查看每个通道的仅二抗对照图像。采用逐次采集模式分别获取 RANKL 和 DMP-1 的图像。 |
| 非特异性背景信号过高 免疫荧光染色 | 蛋白质封闭不充分、二抗浓度过高，或孵育间洗涤步骤不充分。 | 将封闭孵育时间延长至室温下2小时。二抗稀释比例提高至1:1000。使用仅二抗对照（不加一抗）验证特异性。确保所有PBS洗涤步骤均彻底完成（3次） × 每次5分钟。 |
| H评分的观察者间变异性 （Cohen's kappa） <0.7，步骤 5.6 | 观察者之间对四等级染色强度评分标准（0、1+、2+、3+）的应用不一致，或在评分前未进行充分校准。 | 在正式评分前，使用具有代表性的训练图像进行联合校准。所有观察者应采用相同的图像显示设置（亮度、对比度）。每孔至少评分五个高倍视野，并每完成10个视野后计算一次kappa值，以监测评分偏差。 |
| EC₅₀ 曲线不收敛 或拟合效果较差（步骤 4.1） | 数据点不足、浓度范围过窄，或在接种前未达到均匀悬浮状态。 | 将系列稀释范围扩大至至少包含6个浓度，覆盖50–1.56 µg/mL确保在每次稀释步骤前立即进行探头超声处理。至少重复3次独立的生物学重复实验。确认变异系数（CV） <15% 的重复间差异。 |
表2：关键参数与故障排除指南。 实验过程中常见的技术问题、可能原因以及提高实验可重复性和数据质量的建议解决方案。缩写：CV = 变异系数；RT = 室温。
讨论
本方案中的关键步骤包括准确测定EC₅₀、均一的纳米材料悬浮液制备，以及生物学检测结果的标准化。通过非线性回归（四参数逻辑模型）计算EC₅₀，相较于线性插值法可提供更为严谨的剂量-反应估计，当数据点足够时应优先采用此方法13,14。在细胞暴露前立即通过探头式超声处理确保纳米颗粒悬浮液的均一性至关重要；分散不良的悬浮液将导致不可靠的剂量-反应曲线，并干扰EC₅₀的估算。对于NeoMTA2等新型材料，研磨至纳米尺度是必要的初始步骤，因为块体颗粒尺寸会显著改变材料的表面反应性及后续生物活性13,14。若在预期安全浓度下观察到细胞活力较低，研究者应在重复EC₅₀检测前，验证紫外灭菌程序，并重新检查研磨和分散步骤10。
本方案的一个关键在于使用两种互补的免疫荧光标记物，以反映既不同又部分重叠的分化途径。成骨样细胞上 RANKL 的上调反映了钙离子驱动的成骨信号通路，并与成骨细胞数量成正比8,9，而 DMP-1 的表达则是成牙本质样分化和牙本质生成活性的特异性指标，在目标细胞群为牙髓干细胞（DPSCs）时尤为相关10。通过 H-评分法对这两种标记物进行定量，本方案使研究者能够在单一标准化检测体系内区分成骨与成牙本质谱系的定向分化，相较于无法区分成骨与成牙本质分化的单标记方法具有明显优势。所有采用本方案的研究在发表时均应报告 RANKL 和 DMP-1 的 H-评分，以确保不同研究之间的可比性。研究者应对两种二抗使用光谱不同的荧光染料，以避免通道重叠，并在评分前仔细检查仅加二抗的对照图像。
将本方案应用于其他生物材料或细胞模型时，可能需要进行若干方法学上的调整。对于高度不透明或有色的支架材料，其在570 nm处对MTT吸光度的干扰可能需要采用替代的细胞活力检测方法，例如CellTiter-Glo（发光法）或PrestoBlue（刃天青还原法），这些方法受支架材料光学干扰的影响较小。使用SCAPs而非DPSCs的研究人员应注意，SCAPs通常表现出更强的RANKL表达，反映其更高的成骨倾向，而DPSCs则表现出更显著的DMP-1表达，反映其更强的成牙本质/牙源性谱系偏向。传代次数是一个关键变量：应避免使用超过第6代的细胞，因其可能表现出分化能力下降以及表面标志物表达的改变。
该方法学框架的局限性包括评估时间窗较短（72小时），可能无法捕捉通常需要14至21天的晚期矿化事件。缺乏体内验证代表了显著的转化差距。使用H评分可能引入观察者间变异；所有发表结果中均应包含第5.10节报告的观察者间可靠性（Cohen's kappa）。
与现有的单终点方法相比，该体系具有多项优势。传统的成骨分化检测通常仅依赖茜素红染色或单时间点的碱性磷酸酶（ALP）活性检测。本方法在一个统一的实验流程中整合了MTT活力筛选、ALP活性定量以及双标RANKL和DMP-1免疫荧光H评分，提供多参数输出，从而能够在相同实验条件下对不同类型支架材料进行直接的统计学比较。所采用的标准化策略，包括将ALP活性以每毫克蛋白的活性表示、MTT结果以未处理对照组的百分比表示，以及将H评分根据每视野总细胞数进行归一化处理，有效消除了孔间差异带来的干扰4,8。
未来的研究可应用此方法评估生物材料对炎症标志物、血管生成反应或替代干细胞模型的影响。该检测流程也可适用于3D支架体系。最终，在独立实验室中采用这一标准化框架将有助于在临床前再生牙科研究中对支架性能进行有意义的荟萃分析比较15。
披露
作者声明无利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔培养板 | 康宁 | 3527 | 用于碱性磷酸酶（ALP）检测 |
| 96孔板 | 康宁 | 3596 | 用于ALP吸光度测定和MTT实验 |
| ALP 检测试剂盒 | Abcam | ab83369（或同等产品） | 用于测定碱性磷酸酶活性 |
| ALP底物缓冲液（2-氨基-2-甲基-1-丙醇） | Sigma-Aldrich | N/A | 用于启动碱性磷酸酶（ALP）催化反应 |
| 氢氧化铵（NH4OH | N/A | N/A | 用于纳米羟基磷灰石合成过程中的pH调节。腐蚀性 |
| 抗DMP-1一抗 | N/A | N/A | 牙源性标志物；阻断缓冲液中1:200稀释；4℃孵育过夜 4 °C |
| 抗人CD44抗体（CD44-FITC） | 贝克曼库尔特 | N/A | 用于流式细胞术；间充质干细胞阳性标志物 |
| 抗人CD45抗体（CD45-PC5） | 贝克曼库尔特 | N/A | 用于流式细胞术；造血系阴性标志物 |
| 抗人CD73抗体（CD73-PE） | 贝克曼库尔特 | N/A | 用于流式细胞术；间充质干细胞阳性标志物 |
| 高压灭菌器（水热反应釜） | Tuttnauer | N/A | 用于纳米羟基磷灰石的水热处理 140 °C，0.3 MPa |
| BCA 蛋白质测定试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23225（或同等产品） | 用于确定总蛋白浓度，以标准化碱性磷酸酶（ALP）活性 |
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | N/A | 设定为 37 °C 和5% CO2 所有细胞培养步骤 |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 | 用于干细胞分离过程中牙体组织的酶消化 |
| DMEM（Dulbecco改良型Eagle培养基） | Gibco（赛默飞世尔科技） | 11965-092 | 基础培养基；也用作阴性对照组 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 10270-106 | 完全培养基补充剂；用于分化培养基的MSC认证FBS |
| 流式细胞仪（Navios） | 贝克曼库尔特 | Navios | 用于干细胞免疫表型分析 |
| 流式细胞术分析软件（Navios） | 贝克曼库尔特 | N/A | 用于流式细胞术检测 panel 的设门与数据分析 |
| 荧光显微镜 | Labomed / NY 显微镜公司 | 9126000 | 用于免疫荧光成像及H评分 |
| 冷冻干燥机（冻干机） | Labconco | N/A | 用于干燥纳米材料沉淀物 −50 °C |
| 山羊抗兔IgG二抗（Alexa Fluor 488） | Invitrogen | A-11034 | 荧光二抗；1:500 稀释；室温孵育 1 小时 |
| 山羊抗兔IgG二抗（Alexa Fluor 594） | Invitrogen（或同等产品） | A-11012（或同等产品） | 用于多重染色时DMP-1免疫荧光检测的光谱不同的二抗 |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | 版本 9 | 用于EC50 计算与统计分析 |
| 血细胞计数板 | 纽鲍尔 | N/A | 用于手动细胞计数及H评分归一化的总细胞数测定 |
| 倒置相差显微镜 | Olympus | N/A | 用于细胞生长和形态的日常监测 |
| 封片剂，抗荧光淬灭（ProLong Gold） | Invitrogen | P36930 | 用于免疫荧光染色后载玻片封片 |
| MTT试剂 | Invitrogen | M6494 | 用于评估细胞代谢活性；0.5 mg/mL，4小时 37 °C |
| 纳米羟基磷灰石（NHAP） | Nanogate，开罗，埃及 | N/A | 通过湿法沉淀合成或商业采购；使用时 10 µg/mL |
| NeoMTA2 粉末 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | 行星式球磨法制备Nano-NeoMTA2的起始原料 |
| 正常山羊血清 | N/A | N/A | 用于一抗孵育前的封闭（PBS 中配制的 5% 溶液） |
| 成骨/成牙分化培养基 | Gibco（赛默飞世尔科技） | N/A | 阳性对照培养基；包含DMEM、FBS、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松 |
| 4% 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 用于免疫荧光前的细胞固定。有毒 — 在通风橱中使用 |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4） | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 10010-023 | 用于细胞洗涤、抗体稀释和纳米材料悬浮 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco（赛默飞世尔科技） | 15140-122 | 抗生素添加剂；在完全培养基中使用浓度为1% |
| 行星式球磨机 | Retsch（或同等产品） | PM 400 | 用于纳米化 NeoMTA2 粉末；350 rpm，10 h |
| 对硝基苯酚标准品 | Sigma-Aldrich | N/A | 用于生成碱性磷酸酶活性标准曲线 |
| 兔抗RANKL一抗 | Abcam | ab9957 | 成骨标志物；1:200 稀释；4℃过夜孵育 4 °C |
| 兔IgG同型对照抗体 | N/A | 免疫荧光阴性对照；与一抗相同浓度的对照 | |
| SDS-HCl 溶解液 | Sigma-Aldrich | N/A | 用于溶解 MTT 噻唑蓝甲臜结晶。腐蚀性 |
| 六孔组织培养板 | 康宁 | 3516 | 用于分化实验 |
| 氢氧化钠（NaOH），0.5 M | Sigma-Aldrich（或同等产品） | N/A | 用于在测定吸光度前终止碱性磷酸酶反应；具有腐蚀性 |
| 超声波破碎仪（探头式/超声波清洗槽） | Branson Ultrasonics | N/A | 用于生物学检测前纳米颗粒的分散 |
| T-75 培养瓶 | Corning | 430641 | 用于干细胞扩增 |
| TEOS（正硅酸四乙酯） | N/A | N/A | 用于45S5生物活性玻璃溶胶-凝胶合成的二氧化硅前驱体。易燃 |
| 透射电子显微镜 | 日本电子株式会社 | JEM-2100 | 用于纳米材料尺寸和形貌表征 |
| Triton X-100（PBS 中 0.1%） | N/A | N/A | 用于免疫荧光前的细胞通透处理 |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 | 用于细胞活力评估 |
| X射线衍射仪（X'PERT-PRO） | PANalytical | X'PERT-PRO | 用于纳米颗粒的晶体学分析 |
参考文献
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