通过控制发芽和比较培养分离番茄种子相关微生物群

摘要

该方案结合了标准化种子表面灭菌与受控发芽，实现在种子到幼苗过渡期间可重复分离番茄种子相关微生物群。该方法促进了干种子中可培养微生物的回收，并支持早期幼苗发育期间的比较培养学研究。

摘要

表面灭菌是分离种子相关微生物研究中一个关键但常常未达到优化的步骤，因为过于严苛的处理会减少或扭曲内源性微生物群体。该方案采用了基于先前验证方法的表面灭菌条件，结合受控种子发芽，实现可重复的培养番茄种子相关微生物群分离方法。该方法不定义普遍最优的灭菌处理方法，而是采用标准化条件，根据种子特性进行调整，同时最大限度减少偏倚并保护内源性微生物群体。

为增强与种子到幼苗转变相关培养微生物的恢复，该方案在微生物分离前包含受控的发芽步骤。与基于干燥未发芽种子浸泡的传统方法不同，受控发芽促进微生物在种子到幼苗过渡过程中的活化，且在无菌条件下进行。基于比较蜂群形成单元（CFU）的分析，分析了等效生物复制体，每个复制品由3至5个干种子或3至5个发芽幼苗的聚集物组成，显示发芽后可培养群落发生了显著变化。干种子中代表性较弱的属在发芽后变得富集，而其他干种中较为丰富的分类单元相对代表性减少，支持了幼苗建立过程中早期植物与微生物相互作用的研究。

在生物复制中，包括 Stutzerimonas、 Stenotrophomonas和 Priestia 属在从发芽幼苗中分离株中持续富集，而 Paenibacillus 在不同条件下依然丰富，但物种层级组成出现显著变化。通过将标准化灭菌条件与受控发芽及干发芽材料的比较分析相结合，本协议为种子相关微生物群的培养组分离提供了稳健且可重复的框架，并在幼苗早期发育中具有潜在功能性，并支持早期植物与微生物在幼苗建立过程中相互作用的研究。

引言

种子含有由细菌和真菌组成的多样微生物群落，这些菌群既与内部组织有关，也与外部表面相关 ^1,2,3。这些微生物越来越被认可为植物生物学的组成部分，因为它们能从最早发育阶段开始影响植物表现，包括发芽、幼苗建立以及对生物和非生物胁迫的反应 ^1,2,3。从生态学角度看，种子不仅是植物繁殖的繁殖体，也是微生物接种物的储存库，是理解植物相关微生物组如何在植物生命周期中被启动和维持的关键切入点^1,2,3。

种子相关微生物可能是新生植物遇到的第一个微生物接种物，因此能在种子到幼苗转变过程中参与微生物组的组装，1^、3、4。这种早期接种可能影响随后定殖于根系及其他植物区室的微生物群落，从而影响植物的建立以及后续的植物与微生物之间的相互作用 ^1,4。此外，部分种子微生物群可通过花朵、胚珠和花粉等生殖结构垂直传播，使微生物群体能够在植物^4,5代中持续存在。这种代际连续性表明，一些通过种子传播的微生物可能持续促进植物的适应性和适应性。

在功能上，种子相关微生物可能通过多种机制影响宿主表现，包括产生植物激素、抗菌化合物及其他调节植物发育或抑制竞争者和病原^体的生物活性代谢产物^5,6,7。通过种子传播的微生物群体似乎也通过资源利用差异和生态划分共存，表明种子代表的是选择性栖息地，而非被动的微生物多样性容器⁷。综合来看，这些发现支持种子中可能影响早期植物发育的微生物群体，并代表下游功能特征的候选物种^（2,3,5,7）。

为了以功能上既信息量丰富又实验可操作的方式研究种子相关微生物，必须从种子材料中恢复可用的微生物群体。在此背景下，微生物分离提供了对活微生物的访问，这些微生物随后可以通过实验表征并在与植物-微生物相互作用相关的下游检测中进行评估。这在种子系统中尤为重要，因为种子相关微生物可能促成早期植株建立，并成为功能筛选和未来应用的候选对象。

种子相关微生物的回收对样品制备程序极为敏感，尤其是表面灭菌、组织处理以及采样材料的发育阶段。这种敏感性在种子系统中尤为重要，因为微生物生物量通常较低，细微的程序差异会强烈影响形成菌落的单元数和分离物的组成。在这些变量中，表面灭菌是最关键且最难以优化的。灭菌对于减少微生物分离前的附生污染是必要的，但过度暴露于灭菌剂会降低内源性微生物的存活率或培养能力，而灭菌不足则可能使地表相关分类单元主导后续培养物 ^8,9,10.因此，灭菌的目的不是最大化化学暴露，而是采用最温和的处理方法，有效抑制表面来源污染，同时保留可回收的内部微生物^5,11。

由于灭菌效率取决于植物种类、组织结构、种子皮质及相关微生物群落，应从先前验证的方法中选择方案，并谨慎调整以适应研究系统8^、12、13。在低生物量材料如番茄种子中，这种平衡尤为重要：过度灭菌可能显著降低微生物恢复率，而灭菌不足则增加快速生长的表面污染物主导分离株的可能性。因此，应定期核实灭菌效率，而非假设。对最终冲洗水的镀层提供了对残留外部污染的实际控制，但该控制应始终与种子或幼苗均质菌的微生物恢复结合解释。若目标是比较微生物分离而最大净化，而无可回收的内部微生物群，则可能不适用。

因此，有意义的比较需要严格的程序标准化。在低生物量样本中，洗涤、转移、均质化、稀释、装甲或培养的不一致可能改变微生物总恢复率以及单个分类单元的表观表现。这在比较干燥和发芽材料时尤为重要，因为方法学差异容易被误认为是生物变化。

许多种子微生物学方案的一个主要限制是它们完全依赖干燥、未发芽的种子作为起始材料。虽然这为种子活化前存在的微生物分数提供了有用的基线，但可能低估了休眠、代谢不活跃、受胁迫或初始相对丰度较低的微生物 ^2,15。

在干状态下，种子代表一种生理静止的环境，宿主组织及其相关微生物可能相对不活跃。因此，直接从干种子中回收的微生物群体可能并不完全代表发芽后更容易恢复的微生物群体。

在发芽过程中，种子会吸收水分、代谢再激活、养分动员和组织重组，这些都会改变相关微生物可用的局部环境 ^11,16。这些变化可以促进微生物生长，改变微生物种群的相对代表性，并促进此前在干种中稀有或恢复较差的分类单元的检测或恢复。此外，核基出芽创造了一个新的植物区室，可能支持微生物的增殖和再分布，使得种子到幼苗的过渡成为微生物分析中特别有益的阶段 ^1,17。

因此，干种子与发芽幼苗的并行处理比单纯分析干种子提供了更具信息量的实验设计。干种子为活化前可养殖种群建立基线，而发芽材料则可对早期发育中更容易恢复的分类单元进行比较评估。当目标不仅是编目可回收微生物，还要识别与种子到幼苗过渡相关的分类单元并优先分离株进行后续特征分析时，这种方法尤为有用（见图1）。

图1：比较隔离工作流程的概念性和程序性概述。 （A）发芽前干燥番茄种子状况的概念性表示。（B）在种子到幼苗过渡期间发芽番茄种子状况的概念性表示。（C）方案的示意工作流程，包括种子表面灭菌、冲洗控制评估、干种子的直接处理或受控发芽、集结生物复制的均质化、序列稀释和镀层、基于CFU的定量化、分离物回收、分类学鉴定以及干与发芽材料的比较分析。工作流程中强调的关键控制点包括灭菌效率、等效生物复制品，以及一致的电镀和CFU分析。面板A和B仅作为AI辅助的概念性示范，仅用于视觉表现。 请点击此处查看该图的放大版本。

由于该方案旨在比较干燥和发芽材料中的微生物恢复情况，严格的方法学一致性至关重要。所有比较均应使用相同的种子批次、相同的灭菌条件、相同的培养基，以及等效的稀释、镀盘和培养程序进行。如果没有这种标准化水平，干燥样本与发芽样本之间的表面差异可能反映技术差异，而非生物学意义上的富集。这在分离工作流程中尤为重要，因为回收的分数既受生物样本的影响，也受实验程序本身的选择性影响 ^4,15。

生物复制同样不可或缺。低丰度分类单元在种子批次间可能存在差异，且即使在严格控制条件下，微生物从低生物量样本中的恢复本质上也是随机的。每种病症建议至少有五个独立的生物复制体以进行稳健比较。在该工作流程中，每个生物复制品由3至5颗干种子或3至5株发芽幼苗的集合材料组成，作为单一样本处理。此外，灭菌后的所有操作应在无菌条件下进行，以最大限度减少二次污染并保持分离物组的可解读性。

发芽时间也应谨慎选择。它必须足够长以允许根基萌发和幼苗早期发育，但又不能过长以至于后期植物生长会带来与种子到幼苗过渡无关的额外生态复杂性。对于番茄来说，在无菌条件下长达5天的发芽期提供了一个实用的窗口，使幼苗与种子环境保持紧密联系，同时早期微生物的活化和重新分布已经可能发生。实验间时间一致至关重要，因为发育阶段的差异本身可能影响微生物的恢复模式。当目标是在标准条件下评估与发芽相关的转变时，这种工作流程最适合从低生物量种子系统中比较恢复可培养微生物群。它不太适合直接估计种子微生物组总多样性，或在需要采用培养独立方法捕捉更广泛微生物群落的实验系统中。

该方案的目标是通过将标准化的表面灭菌与受控种子发芽相结合，为可培养番茄种子相关微生物群的分离提供可重复的框架。该方法能够比较分析干种子和发芽幼苗，使用等效的生物复制品，每个复制品由3–5个干种子或3–5个发芽幼苗的聚集材料组成，以评估发芽依赖的群体形成单元（CFU）恢复和分类组成的变化。通过减少灭菌偏倚并促进种子到幼苗过渡期间微生物的恢复，这种方法有助于在幼苗早期发育中分离具有潜在功能意义的微生物，并支持对早期植物与微生物相互作用的后续研究。

方案

1. 试剂、培养基和无菌材料的制备

1. 用无菌蒸馏水制备70%（v：v）乙醇溶液。
2. 将20毫升漂白剂稀释于80毫升无菌蒸馏水中，制成含5%次氯酸钠的商业漂白剂，制备20%工作溶液（v：v）。
3. 准备无菌蒸馏水用于清洗步骤。
4. 制备无菌0.45%氯化钠用于均质化和序列稀释，并在整个工作流程中持续使用该溶液。
5. 准备Luria Bertani（LB）琼脂培养基（每升：10克色酮、5克酵母提取物、10克NaCl和15克琼脂），并在无菌条件下提前倒置平板。
6. 所有在灭菌后会接触种子或幼苗的器械，包括产钳、杵、扩张器、剪刀和管架，应采用高压灭菌或经过验证的无菌处理。
7. 在开始种子操作前，将无菌培养皿、管子、移液器头和培养板放入层流罩内。
   注意：由于种子相关微生物生物量可能较低，重要的是尽量减少不必要的处理时间，并在开始灭菌前准备好所有材料。化学处理、洗涤、镀层或发芽设置之间的延迟可能导致恢复过程的变异。其他实验系统中也可使用替代的无菌缓冲液，但在整个比较实验中应始终保持单一缓冲液。扩展的培养基工作流程中可以包含如Reasoner's 2A（R2A）或选择性培养基，但LB琼脂作为此处描述的比较协议的标准培养基。

2. 种子的选择与分配

1. 每次实验都尽可能使用同一批番茄种子。
   注意：在此描述的代表性工作流程中，每次实验均使用单批cv. Money Maker的番茄种子。
2. 目视检查种子，丢弃受损、明显断裂或畸形的种子。
3. 将种子划分为研究所需的实验组。至少，种子应分配到：灭菌后进行干种分离，以及发芽后幼苗分离。
4. 如果要测试多种灭菌条件，应随机分配种子，以避免因种子大小或条件引起的处理偏差。
   注意：所有下游比较在基于同一批种子并行处理时都更为有力。工作流程可以调整到其他番茄基因型或品种，但实验内的任何比较都应使用并行处理的单一种子批次进行。

3. 番茄种子的表面灭菌

1. 将3–5颗种子转移到每个无菌的2毫升微离心管内的层流罩内。
2. 每管加入1毫升70%（v：v）乙醇，使种子完全浸没。
3. 将管子孵育5分钟，并用管子旋转器以25转/分钟轻柔混合。
4. 用无菌移液器完全去除乙醇。
5. 立即向每管加入1毫升20%次氯酸钠工作液，使种子完全浸没。
6. 将管子孵育10分钟，管子旋转器以25转/分钟轻轻搅动。
7. 使用无菌移液器完全去除次氯酸钠溶液。
8. 每次清洗时，用1毫升无菌蒸馏水清洗种子三次。
   1. 每次清洗时，加入无菌水，轻轻搅拌30秒，如果需要让种子沉降30秒，然后完全去除洗涤液后再加入新鲜无菌水。
9. 保留每管的最终冲洗水以控制灭菌效率。
10. 根据是立即处理为干种子还是用于受控发芽，将灭菌种子转移到无菌培养皿或无菌管中。
    注意：使用适当的个人防护装备处理次氯酸钠，并按照机构化学安全程序执行所有步骤。
    注意：此处使用的乙醇-次氯酸钠序列是基于先前验证的灭菌流程，选定为番茄种子的标准化工作条件。对比较实验中所有样本使用相同的灭菌条件。如果评估多种灭菌方案，应同时处理每种治疗，并针对每种病症独立评估灭菌效率。尽量缩短最终洗涤与下游处理之间的时间，以减少微生物恢复的变异性。

4. 灭菌效率验证

1. 将最终冲洗水以无菌0.45%氯化钠中10倍序列稀释，方法是将100微升冲洗水转移到900微升稀释剂中，依次重复相同步骤，最多达到^10-4。将每种稀释物100微升镀入LB琼脂，采用与干种子和发芽幼苗均质菌相同的包板方法。
2. 在28°C下孵育板24–48小时。
3. 孵化后检查平板是否有菌落生长。
4. 记录每次稀释时菌落的有无。如果有菌落，记录稀释水平、近似菌落数量及可见菌落形态。
   注意：在整个实验过程中使用相同的电镀体积和电镀格式，以便直接比较冲洗对照组和生物样本。如果未稀释或最低稀释的冲洗控制板中未检测到菌落，则在所用培养条件下记录为无可检测的菌落生长。

5. 干燥（未发芽）种子的加工

1. 将3–5个消毒干种子组成的集合，对应一个生物复制品，转移到无菌的2 mL微离心管中，内含1 mL无菌0.45% NaCl。
2. 用无菌一次性杵均匀化种子，直到种子组织明显被破坏且无完整种子结构残留。
3. 涡旋均匀地将均质液重新激活30秒。
4. 在无菌0.45% NaCl中，先将100微升均质酸盐转移到900微升稀释剂中，进行第一次稀释，并依次重复相同比例至^10-6，以10倍序列稀释。
5. 将选定稀释物的100微升用扩布板到LB琼脂上。
6. 在28°C下孵育板24–72小时。
7. 选择对应稀释范围的板块，以产生分离和可计数菌落，用于下游的CFU估计和分离回率。
8. 记录总菌落数、可见菌落形态及复制间生长模式的差异。
   注意：使用相同的培养基、稀释方案、镀层体积和孵育条件，与发芽幼苗样本同时进行干种子处理。LB琼脂被用作本文所述比较工作流程的标准培养基。当需要更广泛的缓慢分类单元恢复时，可能会在扩展分离流程中加入额外的培养基。

6. 灭菌种子的轴性发芽

1. 将灭菌种子放置在无菌的发芽支持上，如Murashige和Skoog（MS）琼脂平板。
2. 种子间隔均匀，以避免幼苗接触。
3. 用实验室密封膜或等效材料封板，减少外部污染，同时允许正常发芽。
4. 在黑暗中水平孵化板，温度为25°C。
5. 让种子在无菌条件下发芽，直到早期根基明显可见;在代表性实验中，这对应于5天的潜伏期。
6. 定期检查盘子是否有污染、异常发芽或过度凝结的迹象。
   注意：各复制品间的发芽条件应保持一致。发芽时间或幼苗阶段的变化可能独立于研究效应影响微生物的恢复。其他无菌发芽支持，包括植物葵花平板或无菌湿滤纸，也可以在适应的工作流程中使用，前提是每个实验中的支持保持恒定。根据发芽容器的不同，培养可能采用不同的板状方向，但实验中应保持方向一致。（停顿点）如有必要，发芽幼苗可在4°C下短暂保持，但尽可能优先立即处理。

7. 从发芽幼苗中分离微生物

1. 在层流罩内使用无菌镊子采集已发芽的幼苗。
2. 将3–5个发芽幼苗（对应一个生物复制体）的积聚材料转移到无菌的2毫升微离心管中。
3. 每管加入1毫升无菌0.45% NaCl。
4. 使用无菌一次性杵彻底均质聚集的幼苗材料，确保新生根和残留种子组织均被包含，直到组织明显受损。
5. 涡旋均质液30秒，均匀释放和重新悬浮微生物细胞。
6. 在无菌0.45% NaCl中，先将100微升均质酸液转移到900微升稀释剂中，进行第一次稀释，并依次重复相同比例至^10-4。
7. 将选定稀释液的100微升用扇形板压到LB琼脂上，滴板。
8. 在28°C下孵育板24–72小时。记录总菌落数量、可见菌落形态及相对于干种样本的差异。
   注意：将一个生物复制定义为3–5个发芽幼苗的集合材料，并使用相同的稀释方案、镀层体积、培养基和培养条件并行处理所有复制品。在均质液中同时加入残留种子组织和新出根，以保持发芽苗样本间的一致性。

8. 菌落计数与分离恢复

1. 培养后，选择产生可计数且分离良好菌落的稀释板。使用含有30–300个菌落的板材进行CFU估计。
2. 计算选定板上的菌落数，并用以下公式计算每个生物复制的CFU：
   每次复制CFU = （菌落数×稀释因子）/镀层体积（毫升）
   1. 如果使用同一稀释的多块板，应计算该稀释的平均菌落数后再应用公式。
3. 使用标准化描述符记录群体形态，包括大小、形状、颜色、边缘、高度和不透明度。
4. 选择下游分离的菌落以最大限度减少抽样偏倚。当群体数量较少时，选择所有可区分的形态类型;当群体数量较少时，随机选择多个群体。
5. 将选定的菌落重新划线到新鲜的LB琼脂平板上，获得纯净培养物。
6. 重复重划，直到每个分离株在板上呈现均匀的菌落形态。
   注意：明确报告CFU值是按生物复制、单位生物量或采用其他归一化方法表达的。如果采用了额外的归一化方法，包括基于生物质的归一化，请在数据分析部分明确描述计算方法。

9. 纯化分离株的保存

1. 将纯菌落接种到液态LB培养基中，培养直到出现可见生长。
2. 根据标准微生物学规范，将培养液与无菌80%甘油混合（1：1，v：v）。
3. 冷冻保存温度为-80°C。
4. 为每个分离株保持数字记录，包括样本来源、复制次数、状况（干种子或发芽幼苗）、灭菌处理、分离日期、培养基、菌落形态及下游鉴定状态。
   注意：如果要将富集模式追溯到种子阶段、处理或生物复制，准确的分离元数据至关重要。

10. 分子鉴定分离株

1. 按照制造商的说明，使用细菌DNA提取套件从纯化细菌培养中提取基因组DNA。
2. 利用V5-V8高变区或近乎全长的16S rRNA基因扩增细菌16S rRNA基因。
   1. 为放大V5–V8区域（~700碱基对），使用引子799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1392R（5′-ACGGGGGTGTGTRC-3′）。
   2. 为扩增近乎全长的16S rRNA基因（~1500碱基对），使用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTGTGTTACGACTT-3′）。
   3. 用PCR主混合液、0.4微米每个引物和1微升模板DNA准备每个聚合酶链式反应（PCR），最终体积为25微升。
   4. 在以下条件下使用热循环器运行：初始变性为95°C，持续2分钟;在95°C下进行40个变性循环，持续3秒，45°C退火30秒，72°C拉伸2分钟;随后在72摄氏度下进行最后一次延长，持续7分钟。每次PCR运行中包含无模板控制。
3. 通过电泳验证PCR产物，使用凝胶电泳和成像系统观察扩增子。
4. 按照制造商的说明，使用PCR净化套件纯化PCR产物，并将纯化后的扩增剂提交桑格测序。
5. 对生成序列进行质量检查、裁剪和组装。
   1. 将每个序列与国家生物技术信息中心（NCBI）核苷酸数据库使用BLASTn（高度相似序列的巨母细胞设置）进行比较。
   2. 使用支持度最高的命中来分配分类法。当最佳命中结果显示出足够的比对覆盖率且序列同性至少94.5%时，将分离株分配到属级。
   3. 仅在最佳匹配显示至少98.7%的序列身份、高查询覆盖率且无近缘物种间冲突的顶配时，使用暂定物种级分配。
   4. 如果重复扩增失败或序列质量不足，则将分离株记录为未识别。由于仅凭16S rRNA相似性可能无法解析密切相关的细菌物种，所有物种级的分配应视为临时，并在需要时通过系统发育或基于基因组的分析加以确认。
6. 报告最高支持的分类分辨率的分离性。利用这些鉴定验证基于形态的分组，并优先确定具有代表性的分离株，以便进行下游的基因组和功能分析。
   注意：此分子鉴定步骤旨在支持分离品分类和代表性菌株选择。不应用它来推断不同处理中的群落结构或数量丰度模式。

11. 数据分析

1. 每个条件至少有五个生物复制体进行实验。
   注意：在此工作流程中，每个生物复制品由3至5颗干种子或3至5株发芽幼苗的集合材料组成，作为单一样本处理。
2. 对于每种条件，量化：（i）总CFU回收率，（ii）可见菌落形态数，（iii）纯化分离株数量，（iv）可回收可培养微生物群在属级及相关物种层面的分类组成。
3. 比较干种和发芽苗样本，以评估发芽依赖的总恢复率和分类组成变化。
4. 计算每个分类单元在各条件下总回收CFU的比例。用绝对CFU值计算折叠变化。
5. 使用合适的统计分析软件（例如GraphPad Prism [v11.0.2]）分析定量数据。报告数据为均值±标准差（SD）。
   1. 对于干种子和发芽幼苗样本的两两比较，当数据满足正态性假设时，使用双尾学生t检验。
   2. 当这些假设未被满足时，使用曼-惠特尼U检验。考虑在 p < 0.05 处的统计学上显著的差异。
6. 明确报告每个显示的值是否对应绝对CFU、相对CFU衍生百分比，还是从绝对CFU值计算出的折叠变化。
   注意：在整个研究过程中使用相同的计算标准，以便直接比较干种子和发芽幼苗样本。在介绍分类组成时，明确指出数值是属级还是种级。

12. 关键质量控制点与故障排除

1. 无菌最终冲洗本身并不能证明所选灭菌方案对实验目标最优。在保持内部或紧密与种子结合的可培养微生物恢复的同时，减少外部污染。解释冲洗控制结果以及干种子和发芽苗均质菌的微生物恢复情况。
2. 干燥和发芽样本的回收率低可能表明过度灭菌、过于严苛的均质化、不适当的培养条件或样本处理延迟。在这些情况下，要确认灭菌时间的使用一致，确认组织破坏足够但不过于过重，并确保稀释、装甲和培养均在相同条件下立即且在不同样本条件下进行。
3. 冲洗控制中的高污染，或少数菌落类型快速过度生长，可能表明灭菌不足或在灭菌后处理过程中引入污染。在重复实验前，请复习灭菌时间、清洗步骤、无菌处理以及层流罩内材料的组织。
4. 仅在发芽阶段、生物复制结构、培养基、稀释方案、板状体积和孵育条件在实验中标准化时，解释干样品与发芽样品的生物学差异。
5. 在处理低生物量种子材料时，某一条件下某些分类单元的明显缺失也可能反映采样不足，而非真正的缺失。因此，应进行一致的复制处理和分离层级鉴定，以强有力地解读与萌发相关的转变。

13. 为其他方法保存样本

1. 在验证灭菌效率后，在电镀前，将每个干种子或发芽苗均质液额外200微升分量转移到无菌的1.5毫升微离心管中。
2. 在每根管子上标注样本类型、生物复制编号、处理条件和采集日期。
3. 立即冷冻分纸，并在-80°C下储存，直到下游分析使用。
4. 利用储存的均质物进行辅助方法，如基于DNA的分析、显微镜检测或确认实验，这些都需要相同的起始生物复制。
   注意：在序列稀释和镀层前保存分色样品，以保持原始均质组度。在计划多次下游分析时，通过准备单独的分级样品，避免反复冻融循环。

结果

表面灭菌的执行及外部污染控制
基于先前验证方法的标准化条件下进行表面灭菌，有效减少了外部微生物污染，同时保留了种子来源材料中可培养微生物的回收。最终冲洗水的镀层显示无可检测到的菌落生长，表明在所用条件下有效去除了表面相关微生物。

值得注意的是，冲洗对照中微生物生长的缺失并未伴随干种或发芽幼苗均质菌中可回收微生物的损失。这表明所施加的灭菌条件有效减少了外部污染，同时阻止了加工种子材料中可培养微生物的后续回收。综合来看，这些观察表明该方案在灭菌效率与下游微生物恢复之间实现了预期的平衡。

干种子可培养微生物群的回收有限且组成受限
处理经过灭菌的干燥、未发芽种子时，生物复制品中可培养微生物的回收率始终较低。群体形成单元（CFU）数量普遍较低，培养板通常由有限的形态型主导，表明在这些条件下，只有有限比例的种子相关微生物群能够被轻易恢复。

讨论

本研究结果表明，标准化表面灭菌与受控种子发芽的结合，为种子相关微生物群的培养组分离提供了坚实的框架。该方案的一个关键成果是能够在有效去除外部污染物与保护内源性微生物群体之间取得平衡。这种平衡在基于培养的研究中尤为关键，过于严格的灭菌会减少微生物的恢复，而灭菌不足则可能通过附生微生物的增殖引入偏倚（^6,16）。本方案不定义普遍最优的灭菌条件，而是采用基于先前验证的方法，并可根据种子特性和实验目标进行调整。这些结果表明，这里使用的标准化条件最大限度地减少了外部污染，同时保持了可培养微生物的恢复率。

种子是植物相关微生物群的关键入口，作为微生物的储存库，能够从植物生长的最早阶段开始影响发育，并在植物生命周期中促进微生物组的组装 ^1,2,3

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	01916-500G	LB琼脂培养基的组成部分；15 g/L。
高压灭菌器	Lab1st	SV120H	用于灭菌器具/材料或验证无菌处理。
细菌DNA提取试剂盒	Promocell	PK-MB708-206-100	DNA提取
菌落计数/记录设置	OCS	B079Y5W57N	用于记录CFU、形态类型和板差异；手稿未指明计数器/型号。
冷冻保存瓶	Sigma-Aldrich	Z359033	用于储存甘油库存于-80 °C；虽未明确命名但需要进行保存步骤。
数字分离记录系统	手稿未指明	不适用	用于记录分离元数据：来源、复制、条件、灭菌处理、分离日期、培养基、形态、鉴定状态。
乙醇	VWR	83813440	用于制备70% v/v乙醇溶液以进行种子表面灭菌。
滤纸	Fisher Scientific	11718772	可选的替代发芽支持。
镊子/镊子	Sigma-Aldrich	930229	用于转移种子和收集发芽的幼苗。
基因组DNA提取试剂盒	PromoCell	PK-MB708-206-100	用于从纯化的细菌培养物中提取基因组DNA；未明确指明具体的试剂盒/方法。
甘油，无菌80%	VWR	24388364	与液体培养物按1:1 v/v混合用于制备冷冻库存。
层流罩 Bio48	Faster	LAB-CAP-22	用于无菌种子处理、灭菌转移和准备无菌材料。
LB琼脂培养基	VWR	846495000	用于比较培养；每升：10 g 胰酶解酪蛋白，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，15 g 琼脂。
微离心管	Ratiolab	RATI5615000	用于种子灭菌和样品处理。
MS培养基	Sigma	M0404-10L	提到的无菌发芽支持用于无菌发芽。
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	PCR扩增混合物
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	用于密封发芽板，同时减少污染。
培养皿	Labbox	PDIP-E9N-500	用于发芽设置、接种和处理灭菌种子。
Phytoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	提到的可选替代无菌发芽支持。
移液器套装和吸头	Merck	EP3123000918-1EA	用于移除灭菌溶液、洗涤、稀释和接种。
R2A琼脂培养基	HI-MEDIA	M1743-500G	扩展培养组流程的可选额外培养基。
氯化钠，NaCl	Fisher Chemical	10040460	用于制备无菌0.45% NaCl用于均质化和连续稀释；也是LB培养基的一部分。
次氯酸钠	Carlo Erba	370323	用于制备20% v/v次氯酸钠溶液用于种子表面灭菌。腐蚀性；需要个人防护装备。
无菌一次性研钵	Eppendorf	EP0030120973	用于干燥种子和发芽幼苗的均质化。
涡旋混合器	Fisher Scientific	15901137	用于重悬均质物中的微生物细胞。