本方案描述了生成复合转基因斑马鱼的方法，以及对幼鱼和成鱼中与肿瘤相关的免疫细胞进行成像，并在肿瘤微环境中定量免疫细胞频率的技术。
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方法文章
利用神经母细胞瘤斑马鱼模型对肿瘤微环境中免疫细胞的成像与定量分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的募集是免疫调控和肿瘤进展的重要组成部分。在活体中研究免疫细胞与肿瘤细胞之间的时空关系，有助于揭示TME内的细胞相互作用。然而，利用传统成像和组织学方法在完整生物体中可视化并定量这些相互作用仍具挑战性。斑马鱼因其基因可操作性强、发育迅速，以及在早期发育阶段具有光学透明性，成为癌症研究的有力模型，可实现对荧光标记细胞的可视化观察 体内在此，我们介绍一种在神经母细胞瘤斑马鱼模型中生成、鉴定、成像并定量经不同荧光标记的免疫细胞与肿瘤细胞的实验方案。该方案包括复合转基因斑马鱼的繁育与筛选、幼鱼的活体成像、成年荷瘤鱼的制备与成像，以及对肿瘤区域周围和内部免疫细胞的定量分析。利用转基因报告基因品系，可实现 CD4+ 免疫细胞和 MYCN驱动的神经母细胞瘤细胞可在不同发育阶段进行可视化和分析。该工作流程能够评估免疫细胞在幼鱼和成鱼中相对于肿瘤的定位情况，并可用于比较不同疾病阶段免疫细胞的丰度。本方案提供了一种可重复的方法，用于成像和定量肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞。 体内 利用斑马鱼，可能有助于在其他癌症模型中开展免疫-肿瘤相互作用的研究。
引言
肿瘤微环境（TME）是由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞和血管细胞组成的生态系统1。TME 在癌症进展、治疗反应以及抗肿瘤免疫中发挥着关键作用。在 TME 内，免疫细胞是调控肿瘤命运的关键因素，既可以参与抗肿瘤反应，也可诱导免疫抑制2。了解免疫细胞在 TME 中的募集、分布和功能，对于阐明肿瘤逃避免疫监视的机制至关重要。然而，研究 TME 的传统方法，如终点组织学、流式细胞术和单细胞测序，仅能提供静态的观察结果，且通常需要破坏组织结构，导致空间信息和细胞间相互作用的丢失3,4,5,6,7。此外，这些方法在可视化和定量分析 TME 中免疫细胞方面存在局限性，尤其是在肿瘤发育的早期阶段。
斑马鱼（Danio rerio）因其成本低、发育迅速、身体相对透明以及高度保守的遗传特性，成为癌症研究的有力模型8,9。这些优势提供了一个可重复且可扩展的....
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方案
所有动物实验操作均经波士顿大学乔巴尼安分校机构动物护理与使用委员会批准。 & Avedisian 医学院根据 PROTO202100001 号方案。生成复合转基因斑马鱼、幼体成像、成体组织制备及图像分析的整体工作流程总结如下 图 1.
图 1斑马鱼肿瘤微环境（TME）内免疫细胞的可视化与定量分析工作流程。 实验流程示意图。将免疫报告基因斑马鱼与易患肿瘤的斑马鱼杂交，以产生在免疫细胞（红色）和肿瘤细胞（绿色）中均表达荧光标记的复合转基因后代。通过荧光显微镜筛选胚胎，以鉴定复合转基因鱼。选定的鱼在幼体发育期间进行活体共聚焦成像（<受精后21天（21 dpf）以内的斑马鱼可直接进行活体成像；超过21 dpf的个体则需经过固定、冷冻切片及共聚焦成像处理。该流程实现了对多个发育阶段肿瘤微环境（TME）相关免疫细胞的可视化观察与定量分析。本示意图部分内容使用BioRender绘制。
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结果
整体实验流程如图1所示。将成年Tg(cd4-1:mCherry)斑马鱼与Tg(dβh:MYCN;dβh:EGFP)斑马鱼杂交，以获得双转基因子代，其中CD4+细胞和表达dβh的细胞分别被mCherry和EGFP荧光蛋白差异标记。筛选具有适当荧光标记的胚胎，随后对幼体发育阶段的活体样本进行共聚焦成像分析，或对较大龄鱼体经固定和冷冻切片后进行共聚焦成像分析（图1）。
为了评估CD4+细胞在幼体发育期间与癌前神经母细胞瘤病变的关联，对复合转基因鱼在受精后7天和14天（dpf）进行了成像。选择这些时间点是基于斑马鱼淋巴细胞发育的阶段26,27。代表性共聚焦图像如图2A所示。在7 dpf时，无论是在对照.......
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讨论
本方案利用斑马鱼作为模型生物 体内 用于可视化和定量肿瘤微环境中免疫细胞的模型。成功实施该方法需考虑多个关键因素。首先，必须合理选择并验证复合转基因斑马鱼品系。应筛选幼鱼中预期的荧光表达模式，必要时通过基因分型加以确认。实验前需验证免疫报告基因和癌基因的表达，以确保实验组与对照组的准确分配。其次，在共聚焦成像过程中，准确定位目标区域至关重要。可利用明场成像识别解剖标志，辅助目标组织的定位。例如，在成像前体区域的肿瘤时，可利用眼睛作为定位参考。第三，斑马鱼的正确摆放位置对于充分暴露成像区域至关重要。摆放不当可能降低图像质量或遮蔽目标组织。最后，适当的固定与 immobilization 是减少活体成像过程中运动伪影的必要条件。应优化三卡因（Tricaine）浓度和成像时长，在保持幼鱼存活的同时确保图像质量。
在活体成像过程中，可通过降低激光强度和缩短曝光时间来最小化光毒性。对于成年样本，在操作和成像准备期间应将组织保持在冰上，因为反复冻融可能改变组织完整性。在冷冻切片及从OCT包埋剂中取出组织后，需特别注意小心处理样本。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH；1UL1TR001430、CA215059 和 NS140967）、美国癌症协会（RSG-17-204-01-TBG）、美国国家科学基金会（1911253）以及 Alex’s Lemonade Stand 基金会对 H.F. 的资助；X.Q. 获得了 Warren Alpert 杰出学者奖学金的支持。Y.W. 受波士顿大学本科生研究机会计划（UROP）和 St. Baldrick’s 暑期奖学金计划资助。M.V. 受 St. Baldrick’s 暑期奖学金计划资助。本文内容仅由作者负责，不一定代表 NIH 的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200 µL 凝胶上样枪头 | MilliporeSigma | 1022-0600 | 用于幼体操作 |
| 人工水草 | The Hidden Reef | 62874200000000000 | 可选的繁殖环境 enrichment |
| 次氯酸钠溶液（漂白剂） | Fisher Scientific | 50371500 | 用于胚胎去污染 |
| 细胞计数插件 | 美国国立卫生研究院 (NIH) | N/A | 用于细胞定量的 Fiji 插件 |
| 计算机与显示器 | HP | 2TB68A8#ABA | 用于图像采集与分析 |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 710 | 用于幼体和成体成像 |
| 塑料冷冻模具 | Epredia | 22-050-160 | 用于 OCT 包埋 |
| 冷冻切片机 | Thermo Fisher Scientific | 95-664-0EC70 | 用于冷冻切片 |
| 干冰 | Fisher Scientific | N/A | 用于样品运输 |
| Fiji 软件 | 美国国立卫生研究院 (NIH) | Version 1.54p | 图像分析软件 |
| 细网筛网 | Carolina Biological | 651345 | 用于胚胎收集 |
| 鱼类培养箱 | VWR | 35960-056 | 维持在 28.5°C |
| 镊子 | Fisher Scientific | 10-316B | 用于样品操作 |
| 玻璃底培养皿 | IBIDI | 81218-200 | 用于成像 |
| 低熔点琼脂糖 | Prolab Supply | 9012-36-6 | 用于幼体和成体封片 |
| 交配缸（主缸、隔板、带格栅部分） | Carolina Biological | 161937 | 用于斑马鱼繁殖 |
| 旋转摇床 | Midsci | R2D-30 | 用于过夜孵育期间的固定 |
| OCT 包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 | 冷冻切片的包埋介质 |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma Aldrich | 158127-500G | 固定剂 |
| 塑料培养皿 | MilliporeSigma | BR452000 | 用于胚胎和幼体操作 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14080-055 | 用于洗涤和固定步骤 |
| 塑料移液管 | Fisher Scientific | 50-998-100 | 用于胚胎和幼体转移 |
| 剃须刀片 | Fisher Scientific | 12-640 | 用于样品制备过程 |
| 电导率仪 | YSI | EC300ACC-04 | 用于验证轮虫培养用水的盐度 |
| 轮虫 | The Hidden Reef | 116151603 | 用于幼体饲养 |
| 硫代硫酸钠 | Thermo Fisher Scientific | AAA1762936 | 用于漂白剂中和 |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S25590A | 冷冻保护试剂 |
| 三卡因甲磺酸盐 | Western Chemical | NC0872873 | 麻醉剂；由 Fisher Scientific 销售 |
| 镊子 | Fisher Scientific | 12-000-122 | 用于样品操作 |
| 正置荧光显微镜 | Leica | M165 | 用于荧光筛选 |
参考文献
- Anderson NM, Simon MC. The tumor microenvironment. Curr Biol. 2020;30(16):R921-R925.
- Kumagai S, Momoi Y, Nishikawa H. Immunogenomic cancer evolution: A framework to understand cancer immunosuppression. Sci Immunol. 2025;10(105):eabo5570.
- Keren L, et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 2018;174(6):1373-1387.e19.
- Gerner MY, et al. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 2012;37(2):364-376.
- Pittet MJ, Weissleder R. Intravital imaging. Cell. ....
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