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方法文章

使用自体乳内静脉的双支血管冠状动脉旁路移植猪模型

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DOI:

10.3791/72141

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2026年8月4日

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本文内容

摘要

本研究成功建立了三例使用自体乳内静脉(IMV)的双支冠状动脉旁路移植术(CABG)猪模型。由于未结扎原生的前降支(LAD)和回旋支(LCX),该模型理论上可保留原有的冠状动脉血流,或可为未来有关竞争性血流相关静脉移植物变化的研究提供技术平台。

摘要

大隐静脉是冠状动脉旁路移植术(CABG)中最常用的移植物之一。然而,其较高的远期失败率限制了临床疗效。尽管血流动力学因素被普遍认为是驱动静脉移植物失败(VGF)的主要原因,但其确切的潜在机制仍不明确。目前,大鼠颈总动脉间置静脉移植物模型是研究VGF的主要动物模型。然而,大鼠与人类在心血管生理学和血流动力学方面存在显著差异,限制了研究成果的临床转化。猪是心血管研究的理想动物模型,因其心血管解剖结构和生理特征与人类高度相似。本研究建立了三种双支血管CABG猪模型,采用自体左侧和右侧内乳静脉(IMV)作为移植物,其中一支从主动脉吻合至左前降支冠状动脉(LAD),另一支从主动脉吻合至左回旋支冠状动脉(LCX)。术中超声检查证实代表性动物双侧IMV移植物均有血流通过,而术后计算机断层扫描血管成像(CTA)清晰显示主动脉至LAD的IMV移植物保持通畅。因此,本研究描述了一种技术上可行的方法,可用于建立大型动物CABG模型,为未来VGF的研究提供平台。

引言

大隐静脉由于其易获取性、长度充足以及技术上的多功能性,仍然是冠状动脉旁路移植术(CABG)最重要的血管来源之一1。然而,大隐静脉移植物在CABG术后10年内的失败率可高达61%2,这增加了再次血运重建的需求,并与院内死亡风险升高相关。近年来,越来越多的证据表明,血流动力学因素,特别是竞争性血流和异常的管壁剪切应力,是晚期移植物失败的主要原因3,4,5。然而,合适的动物模型缺乏,已成为相关研究的瓶颈。目前,静脉移植物失败(VGF)的大多数临床前研究仍主要依赖小动物,尤其是大鼠、小鼠和兔,因为这些模型成本低且技术上易于操作,而大型动物移植物模型则相对有限6。建立小动物静脉移植物模型最常用的方法是横断颈总动脉,并用自体下腔静脉连接两个残端7,8,9。但由于小动物与人类在心率和血压方面存在显著差异10,从小动物模型中获得的研究结果可能无法充分反映人类的病理生理机制。

猪是心血管外科的理想模型,因为其心脏在心脏大小、冠状动脉解剖结构和手术操作特性方面与人类心脏非常相似11,12。此外,猪和人类的冠状动脉在解剖和血流动力学特征上高度相似,且已证实猪能够重现静脉移植物病变的病理表型13,14。因此,在猪模型中实施使用静脉移植物的冠状动脉旁路移植术(CABG),可能为研究静脉移植物功能障碍(VGF)提供一种更优越的动物模型。

本研究采用巴马香猪模型,建立了三种体外循环下的双支血管冠状动脉旁路移植术(CABG)模型,均使用双侧自体乳内静脉(IMV)作为移植物。其中一支IMV移植物从主动脉吻合至左前降支冠状动脉(LAD),另一支从主动脉吻合至左回旋支冠状动脉(LCX)。在一个代表性模型中,术中超声评估证实两条静脉移植物均通畅,术后计算机断层扫描血管成像(CTA)显示主动脉至LAD的IMV移植物通畅。值得注意的是,该模型中未结扎目标部位的原生冠状动脉。因此,该模型最适合用于研究目标冠状动脉中竞争性血流对移植物血流动力学及移植物功能障碍的影响。然而,本研究并未直接测量目标冠状动脉中的竞争性血流。因此,本研究主要验证了该模型建立的技术可行性。

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方案

本研究中的动物实验已获得中国医学科学院阜外医院机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准(批准号:0110-1-10-ZX(X)-07)。所有操作均严格遵守动物福利法规和伦理准则,以确保符合相关标准。所用试剂和设备列于材料表中。建立该模型的目的是为研究竞争性血流对血管生成因子(VGF)的影响提供一个潜在平台。因此,在完成冠状动脉旁路移植术后,未结扎吻合口近端的冠状动脉主干。

所有操作均需遵循机构的生物安全和动物福利规定。使用适当的个人防护装备处理锐器、电外科设备、抗凝血液、体外循环(CPB)管路及生物材料。使用电外科设备前,确认设备接地良好。全身肝素化后及启动体外循环前,应密切监测活化凝血时间(ACT)。启动体外循环前,须确保所有插管和体外循环管路完全排气,以降低空气栓塞风险。

1. 冠状动脉旁路移植术(CABG)的动物准备

  1. 选用健康的雄性巴马香猪,通常体重为35–40 kg,年龄为10–12个月,在手术前让其在饲养环境中适应1周。
  2. 进行基线检查,包括记录体重、全血细胞计数、血清生化、超声心动图和CTA。

2. 麻醉与监测

  1. 麻醉前禁食 8–12 小时,禁水 2–4 小时。
  2. 通过肌内注射氯胺酮(10 mg/kg)和咪达唑仑(1 mg/kg)诱导麻醉(遵循机构批准的方案)。
  3. 使用吸入式异氟烷(2%–3%)联合右美托咪定(1 µg/kg/h)和丙泊酚(1–2 mg/kg/h)输注维持麻醉。
  4. 通过检查下颌肌肉松弛以及脚趾捏压无疼痛反应,确认麻醉效果充分。
  5. 在颈部做一个4–6厘米的切口,以暴露颈静脉和颈动脉。
  6. 建立静脉通路 通过 使用5 F三腔中心静脉导管经颈静脉置管,用于中心静脉压(CVP)监测和药物输注。
  7. 使用20 G动脉导管建立颈动脉通路,用于实时监测血压和血流动力学参数。
  8. 使用20 G动脉导管建立股动脉通路,用于下肢血压和血氧饱和度监测。
  9. 使用6.5–8 mm气管插管进行经口插管。确认气流通畅,并提供100%氧气。
  10. 在下腹部做一个2–3厘米的切口,暴露膀胱壁。用细缝线将膀胱固定于切口边缘,然后建立膀胱瘘管。将一根10 F导尿管插入膀胱,用5 mL无菌水充盈球囊,然后轻柔牵拉导尿管,直至球囊紧贴膀胱壁。将导尿管连接至尿液收集袋,以引流尿液并进行监测。
    注意:由于雄性猪的尿道较长且弯曲,插入导尿管较为困难。因此,需建立膀胱造瘘以引流尿液,便于术后早期监测尿量。导管应尽早拔除,最好在术后24–48小时内,当猪已清醒、血流动力学稳定且无需继续进行持续尿量监测时。
  11. 持续监测心电图、有创动脉压、血氧饱和度2,终末呼气二氧化碳2体温和尿量。

3. 手术暴露

  1. 将猪置于仰卧位。
  2. 使用聚维酮碘对整个前胸部和上腹部进行剃毛和消毒,然后铺巾覆盖手术区域。
  3. 使用电外科设备(ESU)从颈中部沿中线向下至剑突下方做一正中切口。
  4. 使用胸骨锯沿中线从剑突向上行正中胸骨切开术。用电外科设备(ESU)烧灼胸骨切缘,并在骨髓腔处涂抹骨蜡以实现止血。
  5. 使用胸骨牵开器保持胸腔开放。

4. 采集两条自体IMV血管通路

  1. 按300 U/kg剂量给予肝素,以实现全身抗凝,预防手术过程中发生血栓形成。
  2. 使用电外科设备(ESU)游离腹壁下静脉(IMV)周围组织。用剪刀切断侧支,并使用电外科设备实现止血。
  3. 用止血钳夹闭左侧腹壁下静脉远端。在止血钳近端稍前方用手术刀做一切口。通过切口插入钝头冲洗针,并用5-0不可吸收聚丙烯缝线固定。结扎后,完全切断左侧腹壁下静脉远端。
  4. 确保获取的静脉移植物长度足够(约7–8 cm)。用止血钳夹闭左侧腹壁下静脉近端。在夹闭部位远端切断腹壁下静脉,并用5-0不可吸收聚丙烯缝线结扎近端。成功获取的腹壁下静脉应长7–8 cm,无明显痉挛或扭曲,且无可见的侧支出血。
    注意:腹壁下静脉管壁较薄,易发生痉挛。应避免直接抓持、过度牵拉和高压扩张。尽可能通过周围组织操作移植物,并在获取后立即置于冰冻的肝素罂粟碱生理盐水中保存。
  5. 将左侧腹壁下静脉置于冰冻的肝素-罂粟碱生理盐水(30 mg 罂粟碱和2,500 U 肝素溶于500 mL生理盐水中)中。
  6. 采用相同方法获取右侧腹壁下静脉。

5. 建立并启动体外循环(CPB)

  1. 沿纵轴切开心包,并用牵引缝线悬吊。
  2. 确保激活凝固时间(ACT)> 480 秒。
  3. 使用5-0不可吸收聚丙烯缝线放置两个同心荷包缝合线。通过18 F动脉插管建立中心动脉插管。充分排气后,将动脉插管连接至体外循环回路的动脉管道。
  4. 在右心房使用24 F静脉插管建立静脉插管,并连接至静脉管道。
  5. 启动体外循环(CPB)。缓慢建立动脉灌注,随后进行静脉引流。在接下来的数分钟内,根据全身动脉压、静脉回流、储血器液面及整体灌注参数逐步增加泵流量。
    注意:由于巴马小型猪的血容量相对较小,体外循环回路应充分预充2 L乳酸林格液和500 mg甲基泼尼松龙。若发生过度血液稀释,可根据需要考虑输血。

6. 主动脉阻断与心脏停搏

  1. 通过荷包缝线将顺行性心脏停搏液灌注导管置入主动脉根部。将心脏停搏液导管连接至心脏停搏液灌注管路。
  2. 在动脉灌注导管与心脏停搏液通路之间位置夹闭升主动脉。
  3. 使用 4 °C 的改良圣托马斯溶液(10–15 mL/kg)诱导心脏停搏。在心脏表面覆盖冰屑以实现快速降温并保护心肌。
    注:圣托马斯溶液的配制参照 Pfizer Hospital US Plegisol 产品说明,NDC 00409-7969-05:每 100 mL 溶液含氯化钠 643 mg、氯化钾 119.3 mg、六水合氯化镁 325.3 mg、二水合氯化钙 17.6 mg,溶剂为注射用水;使用前每 1,000 mL 溶液中立即加入 10 mL 8.4% 碳酸氢钠溶液。

7. 肠系膜下静脉移植物的远端吻合

  1. 通过钝头冲洗针将4 °C的肝素罂粟碱生理盐水(按步骤4.5所述方法配制)注入移植物,检查是否有渗漏,修剪游离端,并放置8-0不可吸收聚丙烯缝线。
  2. 使用显微外科剪刀切开左回旋支(LCX),插入管腔内分流器。
  3. 使用8-0不可吸收聚丙烯缝线,采用降落伞缝合技术,将一条大隐静脉(IMV)移植物的一端与左回旋支(LCX)行端侧吻合。
  4. 移除分流器。向大隐静脉(IMV)移植物内注入肝素化自体血液,以扩张血管,排出任何滞留的空气,并检查吻合口及侧支是否有渗漏。注入肝素化自体血液后,移植物应均匀扩张,无局部狭窄、扭曲,或侧支及远端吻合口渗漏。完成大隐静脉(IMV)移植物与左回旋支(LCX)之间的吻合。
    注意:肝素化自体血液直接取自体外循环(CPB)管路。肝素化自体血液的总体积应至少为50 mL,每次注射的具体体积应根据移植物的扩张情况以及移植物或吻合口是否渗漏进行调整。
  5. 采用相同方法,将另一条大隐静脉(IMV)移植物的一端完全与前降支(LAD)侧壁吻合。

8. IMV 移植物的近端吻合

  1. 移除停跳液灌注导管。使用3.5 mm打孔器在该位置创建一个开口。
  2. 通过钝性冲洗针将室温肝素-罂粟碱生理盐水(肝素、罂粟碱与生理盐水的比例见步骤4.5)注入吻合至前降支(LAD)的内乳静脉(IMV)移植物中。待IMV移植物扩张后,部分夹闭该移植物,并切断与钝性冲洗针相连的一端。随后使用组织剪进一步修剪游离端。
    注意:此步骤中应避免使用4 °C的肝素-罂粟碱生理盐水,以减少移植物痉挛。肝素-罂粟碱生理盐水的具体注射量应根据维持IMV移植物扩张所需量来确定。
  3. 截取一段动脉导管并连接至左心室排气管。连接完成后,将动脉导管通过打孔的开口插入主动脉。
  4. 以与步骤8.2相同的方式处理吻合至回旋支(LCX)的IMV移植物。
  5. 使用3.5 mm打孔器在主动脉根部左侧创建一个开口。
  6. 将吻合至回旋支(LCX)的IMV移植物游离端与主动脉根部左侧的开口行端侧吻合,并暂不完成吻合。
  7. 通过此吻合口将左心排气导管插入主动脉根部。
  8. 将远端吻合至前降支(LAD)的IMV移植物游离端与主动脉根部的另一开口行端侧吻合。
  9. 移除左心排气导管。使用显微止血夹夹闭两根IMV移植物。完成两根IMV移植物与主动脉的吻合。
    注意:在再灌注前,两根IMV移植物应无张力、无扭曲,且近端和远端吻合口无明显渗漏。

9. 再灌注、脱离体外循环及拔管

  1. 松开主动脉阻断钳,恢复心脏灌注。
  2. 根据需要,在吻合口或内乳静脉桥血管沿线增加使用8-0不可吸收聚丙烯缝线,以实现止血。
  3. 当猪的血流动力学稳定且心脏功能恢复至足够水平后,逐步脱离体外循环(CPB)。
  4. 拔除主动脉和右心房插管,并确保所有插管部位止血彻底。
  5. 脱离体外循环后,按照机构标准方案,使用术中多普勒超声评估两条桥血管。采用彩色多普勒成像检测左前降支(LAD)和左回旋支(LCX)桥血管内的血流信号,记录桥血管位置、血流方向及定性通畅性。如有条件,可进行 transit-time 流量测量(TTFM),以定量评估桥血管血流。

10. 止血与关胸

  1. 在近端主动脉吻合口、远端冠状动脉吻合口、内乳静脉取材区、主动脉和心房插管部位以及胸骨切口边缘,实现彻底的止血。
  2. 置入两根引流管。
  3. 逐层对合胸骨,并分层缝合肌肉、筋膜、皮下组织和皮肤。
  4. 将猪转移至有监测的术后恢复区。

11. 术后护理与随访

  1. 持续使用加热垫或强制空气加温毯维持体温支持,使猪的核心体温保持在 37.0–38.5 °C。
  2. 每日记录猪模型的液体出入量、意识水平、心率、动脉血压、中心静脉压、全血细胞计数及血气分析结果。
  3. 术后早期使用 100% 氧气进行机械通气支持,以确保稳定的气体交换并防止缺氧引起的肺血管收缩。当猪恢复有力且规律的自主呼吸、表现出保护性吞咽反射,并达到满意的动脉血气结果时,逐步减少通气支持并拔除气管插管。
  4. 术后抗菌药物预防:术后 48–72 小时内,每 8–12 小时给予头孢呋辛钠(3–5 mg/kg)。每日评估动物是否有感染迹象。每日检查胸骨切口及引流管部位是否存在异常渗出物或脓肿形成。
  5. 每 2–4 小时使用标准的猪行为疼痛评分量表评估动物的疼痛表现。监测胸骨切开术后常见的疼痛指征,包括发声、弓背姿势、不愿活动、磨牙或社会性孤立。根据动物的行为表现给予阿片类药物或非甾体抗炎药(NSAIDs),以确保充分的镇痛效果和顺利恢复。
  6. 及时调整血管活性药物(如多巴胺、肾上腺素)和液体支持,以维持稳定的动脉血压(>70 mmHg)。
  7. 根据机构标准影像学方案,在术后第 1 天和术后第 28 天通过 CT 血管造影(CTA)评估术后移植物通畅性。

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结果

三只巴马香猪P1、P2和P3接受了双支冠状动脉旁路移植术(CABG)。三只动物均存活超过7天。图1展示了关键手术步骤,包括胸骨正中切开、双侧自体大隐静脉的获取、心包切开以暴露主要血管、体外循环(CPB)的建立、通过主动脉灌注心脏停跳液、冰屑降温使心脏冷却、双支CABG的远端和近端吻合、脱离体外循环、超声评估移植物通畅性、关胸以及术后CT血管造影(CTA)。

对一只代表性动物进行了术中超声评估和术后CTA检查。图2A显示,术中通过超声可检测到主动脉至LCX和主动脉至LAD两支旁路移植血管内的血流信号,表明这两条移植血管在术后即刻具有技术通畅性。图2B显示术后第1天进行的CTA检查,证实了升主动脉至LAD移植血管的通畅性。由于未通过术中超声评估原位LAD和LCX的血流,且未进行TTFM、FFR、压力导丝评估、多普勒衍生的定量血流分析以及计算流体力学建模,因此这些影像学结果仅支持移植血管在术后即刻的技术通畅性,但无法确认是否存在竞争性血流及其程度。此外,在当前的成像条件...

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讨论

本研究采用双侧自体乳内静脉(IMV)建立了三例双支血管冠状动脉旁路移植术(CABG)的猪模型。在两条IMV移植物中,一条用于构建从主动脉至左回旋支(LCX)的旁路,另一条用于构建从主动脉至前降支(LAD)的旁路。尽管大隐静脉是CABG临床应用的标准静脉移植物,但选择IMV的原因在于巴马香猪的大隐静脉过短,无法在无张力条件下为从主动脉至LAD和从主动脉至LCX的旁路各提供一条游离移植物。成功建立该模型涉及多个关键技术步骤,包括无创性IMV获取、使用肝素-罂粟碱盐水预防移植物痉挛、体外循环(CPB)的稳定建立、充分的心肌保护、远端和近端吻合口的精细制作,以及术后严密监测。该模型的一个关键特征是,在CABG术后,并未在远端吻合口近端结扎原生的LAD和LCX。因此,该模型保留了原有的冠状动脉血流,旨在构建一种理论上移植物血流与原生冠状动脉血流可共存的手术环境。在其中一例代表性动物中进行了术中超声评估和术后CT血管成像(CTA)。术中超声证实两条静脉移植物均通畅,术后CTA显示从主动脉至LAD的IMV移植物通畅。三只猪均存活超过7天,最长存活时间超过28天。

在模型建立过程中,采用了多种技术...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由国家重点研发计划(2023YFF0724701)、国家前沿生物技术重点专项等项目资助。 &中国科学技术部“#38; D计划”(2023YFC3404300,项目负责人:Jiangping Song),中国医学科学院阜外医院中央高水平医院临床科研基金,儿童心力衰竭原位心脏异种移植中多基因编辑供体猪心脏的临床前研究(2025-GSP-ZD-4),中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重点实验室项目,原位心脏异种移植长期存活药物靶点的筛选与开发(2025-GSP-GG-42)。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10度主动脉阻断钳SinoviewCP40431-19CABG手术
45度主动脉阻断钳SinoviewCP40044-18CABG手术
Affinity Fusion氧合系统MedtronicBB841体外循环
麻醉机MindrayA9麻醉及其他
动脉插管Medtronic18Fr体外循环
阿曲库铵恒瑞医药-麻醉及其他
无创平头镊SureMedGF04021-25CABG手术
无创平头镊SureMedGF04016-25CABG手术
平衡手柄笔式显微外科镊SinoviewFC12010-21CABG手术
巴马小型猪中国科学院动物研究所北方大型动物研究设施-实验动物
Belzer UW冷保存液Bridge to Life Ltd.1000 ml/袋CABG手术
黑色手柄极锐剪刀SinoviewSC35101-23UCCABG手术
血气分析仪EdiagnosisPT1000麻醉及其他
钝头灌注针BD305180冲洗和扩张内乳动脉桥血管
骨蜡EthiconW31G止血
体外循环管路MedtronicB-HL-159体外循环
中心静脉导管百和医疗-麻醉及其他
弯头镊SureMedGC01002-12CABG手术
弯头镊SureMedGC01002-16CABG手术
一次性血液微栓过滤器SansinFAF-2体外循环
一次性储血器滤器SansinFCR300K体外循环
一次性心脏停搏液灌注系统MedtronicXP41体外循环
多巴胺九安制药-麻醉及其他
电外科设备MedtronicVLFT10FXGENCABG手术
气管插管亚新医药YS-0000麻醉及其他
肾上腺素津药制药-麻醉及其他
精细解剖镊SureMedGC01090-20CABG手术
金色手柄超锐剪刀SinoviewSC35001-23SCCABG手术
人工心肺机LivaNovaS5体外循环
肝素华北制药-麻醉及其他
冰桶SureMedGQ13018-00DCABG手术
输液泵中生医疗SN-C8麻醉及其他
腔内分流器Medtronic31200CABG手术
静脉导管KDL16G-26G麻醉及其他
异氟烷鲁南制药-麻醉及其他
异丙肾上腺素海思科制药-麻醉及其他
氯胺酮Hikma Pharmaceuticals0143-9509-10麻醉及其他
乳酸林格液科伦药业-麻醉及其他
大号盆SureMedGQ13033-00DCABG手术
喉镜汉飞亚TD-C-III麻醉及其他
盐酸利多卡因注射液科伦药业有限公司H20057816CABG手术
注射用硫酸镁正大天晴药业有限公司H20051792CABG手术
医用电动胸骨锯京东西机HF-X01CABG手术
中号盆SureMed-CABG手术
中号胸骨牵开器SureMedGR04130-00CABG手术
咪达唑仑Hikma Pharmaceuticals0641-6220-10麻醉及其他
改良St. Thomas溶液自制-麻醉及其他
多参数监护仪MindrayBenoversion N17麻醉及其他
荷包缝合穿针器SureMedGR04074-00CABG手术
去甲肾上腺素海思科制药-麻醉及其他
盐酸罂粟碱Sigma-AldrichP3510保存内乳动脉移植物
小儿胸骨牵开器SureMedGR04114-00CABG手术
笔式显微外科持针器SinoviewNH11300-21CABG手术
氯化钾注射液科伦药业有限公司H42021164CABG手术
丙泊酚Hikma Pharmaceuticals0641-6194-10麻醉及其他
硫酸鱼精蛋白优凯制药-麻醉及其他
荷包缝合导入器SureMedGR04074-00CABG手术
Resano无创魔术镊SinoviewFC25501-23SCABG手术
直角镊SureMedGC01110-14CABG手术
直角镊SureMedGC01089-18CABG手术
小号盆SureMed-CABG手术
醋酸钠林格注射液多瑞药业有限公司H20163331CABG手术
碳酸氢钠注射液科伦药业有限公司H20043739CABG手术
St. Thomas溶液Pfizer Hospital US00409-7969-05心脏停搏
胸骨牵开器(中号)SureMedGR04130-00CABG手术
直头镊SureMedGC01001-12CABG手术
直头镊SureMedGC01001-16CABG手术
5-0 Prolene BB缝线Ethicon-CABG手术
8-0 Prolene缝线Ethicon-CABG手术
Prolene Blum 4-0 SH 36缝线Ethicon-CABG手术
2-0 Prolene Blu M SH缝线Ethicon-CABG手术
BB 4-0 Prolene缝线Ethicon-CABG手术
温度探头3M-麻醉及其他
扁桃体钳SureMedGC09009-20DCABG手术
碳化钨环柄持针器SureMedGN01013-22KCABG手术
碳化钨环柄持针器SureMedGN01010-22KCABG手术
UW溶液Belzer-麻醉及其他
静脉插管Medtronic28Fr, 32Fr体外循环
呼吸机MindraySV300麻醉及其他
加重笔式持针器SinoviewNH10400-23CABG手术

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