一种采集斑马鱼恶性与非恶性淋巴细胞的新型鳞片活检方法

摘要

一种新型的鳞片活检方法可从活体斑马鱼中收集急性淋巴细胞白血病细胞。结果显示，野生型（WT）斑马鱼鳞片中含有丰富的淋巴细胞，而患有急性淋巴细胞白血病（ALL）的斑马鱼鳞片中淋巴细胞数量显著增加。该技术实现了对表皮正常及恶性淋巴细胞的微创研究。

摘要

斑马鱼（Danio rerio是研究淋巴细胞生成和淋巴样肿瘤的有力模型，因为斑马鱼与人类具有相似的适应性免疫系统，包括B细胞和T细胞。多个 D. rerio T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）模型的建立，包括表达淋巴母细胞特异性人源基因的鱼类模型 MYC (hMYC）。我们报道了 rag2:hMYC 鱼类也会发生B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），因此可用于研究两种类型的急性淋巴细胞白血病（ALL）。斑马鱼ALL模型的一个局限性在于，目前尚无可用于对ALL进行系列取样的非致死性方法。为解决这一问题，我们首创了一种新型的“鳞片活检”方法，用于从活体斑马鱼中采集ALL细胞。然而，关于正常斑马鱼鳞片中存在哪些淋巴细胞的知识仍十分有限。因此，为了明确正常表皮淋巴细胞的种类特征，我们对缺乏白血病病变但携带淋巴细胞标记的转基因品系斑马鱼进行了鳞片活检。 rag2:hMYC我们采用常规显微镜和共聚焦显微镜分析鳞片，发现表皮中存在大量淋巴细胞。我们还分析了患有T细胞和B细胞急性淋巴细胞白血病（T-和B-ALL）的鱼类鳞片，结果显示在许多鳞片中，ALL细胞呈融合片状分布，且淋巴细胞数量显著增加。接下来，我们利用荧光激活细胞分选技术（FACS）从鳞片中分离非恶性及ALL淋巴细胞，以进行后续研究 离体 研究。对同一尾鱼的鳞片或其他组织中的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞进行流式细胞术和表达分析显示，鳞片中ALL细胞的基因表达特征与鱼体其他部位的ALL细胞相似。我们还量化了每片鳞片可纯化的正常T细胞、B细胞、T系急性淋巴细胞白血病（T-ALL）和B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）细胞的数量。总体而言，鳞片活检提供了一种非致死性、微创的技术手段，可用于研究斑马鱼表皮淋巴细胞，从而实现 离体 研究，包括恶性样本的分析。

引言

哺乳动物皮肤的屏障功能及其在免疫中的作用已得到确立^1,2,3。哺乳动物的淋巴细胞参与皮肤免疫，其中细胞毒性T细胞位于表皮，而B细胞、T细胞和自然杀伤（NK）细胞存在于真皮层^1,3,4,5。斑马鱼具有这些淋巴细胞，表达表面免疫球蛋白、T细胞受体、主要组织相容性复合体（MHC）受体、细胞因子及其受体以及其他免疫分子，因此具备大多数哺乳动物的免疫学特征^6,7,8,9。近期对斑马鱼皮肤和鳞片的研究揭示了多种皮肤淋巴细胞群体，包括上皮内T细胞和B细胞^10,11，以及促进T细胞迁移和抗原监视的淋巴样网络

方案

所有动物实验程序均经俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：24-028-EAH 和 25-068-EACHIR）。本方案介绍了一种从活体斑马鱼鳞片中分离和分析正常和/或恶性淋巴细胞的方法，并详细说明了这些操作的目的、实施步骤及其基本原理。

警告：MS-222 是一种危险化学品麻醉剂，操作时必须佩戴适当的个人防护装备（PPE），例如实验室手套、护目镜和实验服。MS-222 溶液的处置应符合机构的化学废弃物处理指南。操作针头和镊子时需谨慎，以防锐器损伤。所有生物样本均应视为潜在的生物危害物，并根据机构的生物安全规程处置废弃物。

1. 分选培养基的制备

1. 在1× RPMI 1640培养基中添加1%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。
   注：RPMI 1640培养基可维持淋巴细胞在体外（ex vivo）的存活能力。RPMI 1640可用0.9× PBS替代。胎牛血清（FBS）提供促进细胞存活的生长因子。青霉素和链霉素用于限制细菌污染。
2. 将培养基以500 µL体积分装至1.5 mL微量离心管中，每管用于处理10–20个鳞片。将分装好的培养基管置于冰上保存。

2. 斑马鱼麻醉、荧光显微镜筛选与成像<....

结果

按照上述步骤，我们通过显微镜对成年斑马鱼进行麻醉并筛选表达荧光的淋巴细胞或急性淋巴细胞白血病（ALL）。野生型（WT）lck:GFP 斑马鱼的荧光主要出现在胸腺区域，而 cd79b:GFP 斑马鱼的荧光则位于头部/鳃部区域，与先前的观察结果一致¹⁰（图1A，左）。相比之下，携带T-ALL的双转基因 rag2:hMYC; lck:GFP/lck:mCherry 斑马鱼或携带B-ALL的 rag2:hMYC + cd79b:GFP 斑马鱼在整个体内表现出明亮且弥散的荧光信号（图1A，右），从而提供了大量高荧光强度的鳞片用于活检。

去除后，鳞片仍保持完整，表皮组织附着在其表面。对固定后的鳞片进行常规和共聚焦成像，观察到分散的GFP⁺ 野生型表皮中的淋巴细胞 lck:GFP 和 .......

讨论

本方案描述了一种非致死性的鳞片活检方法，用于采集斑马鱼表皮淋巴细胞，包括非恶性淋巴细胞和急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞。斑马鱼是研究淋巴细胞生成及淋巴系统恶性肿瘤的成熟模型，但目前大多数获取淋巴细胞的方法均需实施安乐死并进行组织解剖，因而无法对单个动物进行纵向追踪研究^8,10,13,15。鳞片是一种实验上易于获取的上皮结构，富含淋巴细胞，并且由于成年斑马鱼拥有数百片鳞片，且在移除后可快速再生^10,24，因此可实现多次取样。因此，鳞片活检是一种可行的策略，可用于对淋巴细胞（如白血病负荷）进行系列监测，并为后续检测制备单细胞悬液，同时无需处死实验动物。

实现可重复的高细胞回收率需注意多个关键步骤。首先，充分的麻醉以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂 &和耗材：
三卡因甲磺酸盐（MS-222）	Sigma-Aldrich	E10521	麻醉剂
RPMI 1640 培养基	ThermoFisher	11875093	淋巴细胞存活率培养基
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F2442	细胞活性检测
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122	限制细菌污染
70% 乙醇	赛默飞世尔科技	T038181000	对镊子进行灭菌
CellPro 1x PBS	VWR	104027-280	用无菌水稀释至0.9倍
碘化丙啶	Invitrogen	P1304MMP	活细胞/死细胞鉴别用于流式细胞术/荧光激活细胞分选
切割物品 混杂-零件号；尺寸：12 x 12 英寸 35微米滤纸 Lab Pak 03-35/16	Sefar		用于细胞分选 参考文献 Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. 从 lck:Egfp 斑马鱼中分离恶性与非恶性 B 细胞. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
滤纸的替代品：EASYstrainer 细胞筛，Greiner Bio-One	Greiner	89508-342	用于细胞分选
Eppendorf® Flex-Tubes® 微量离心管，1.5 ml	Eppendorf®	20901-551	用于细胞分选的微量离心管
UltiCare VetRx U-100 胰岛素注射器 3/10cc 31G x 5/16" 半单位标记	UltiCare	9436	用于鳞片活检
100 x 25 mm 深型培养皿	USA Scientific	8609-0625	用于鳞片活检
Bel-Art® 一次性研杵	Bel-Art®	BAF199230001	用于鳞片解离
E-Z Pik 6件套镊子套装	Aven	18480EZ	用于鳞片活检
康宁® 显微镜载玻片，单侧磨砂，一端磨砂	Sigma-Aldrich	CLS294875X25	用于成像
盖玻片	Sigma-Aldrich	C8181	用于成像
SlowFade™ 含DAPI的玻璃软封抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	S36920	用于将鳞片固定在载玻片上
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	用于RNA提取
设备：
Nikon AZ100 显微镜和 DS-Qi1MC 相机	尼康		荧光显微镜 &和相机
CFX96 Touch-PCR 系统	Bio-Rad	3600037
CytoFLEX	Beckman-Coulter		流式细胞术分析
Leica SP8	Leica		共聚焦显微镜
软件：
Kaluza 分析软件版本 2.1	Beckman-Coulter		流式细胞术分析 参考文献 https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
LAS-X 软件版本 3.7.4.23463	Leica		共聚焦显微镜 参考文献 https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/