我们已确定胎盘是发育过程中的主要造血器官。研究发现，造血干细胞（HSCs）在胎盘内独特的微环境生态位中生成并扩增。本文描述了从小鼠胎盘中分离和可视化造血干细胞所需的实验技术。
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摘要
摘要
造血干细胞（HSCs）具有自我更新的能力，并能在个体整个生命周期中产生所有类型的血细胞。所有HSCs均在胚胎发育过程中产生，此后其细胞池数量通过自我更新的细胞分裂得以维持。由于在胎儿造血过程中有多个解剖位点参与，识别HSCs的解剖起源以及调控HSC发育过程的关键发育事件一直较为复杂。最近，我们发现胎盘是一个重要的造血器官，HSCs在其中独特的微环境生态位中生成并扩增（Gekas等，2005；Rhodes等，2008）。因此，胎盘在HSCs的出现及其初始扩增阶段是一个重要的HSCs来源。
本文介绍了从E10.5和E12.5小鼠胚胎中分离胎盘的解剖技术，这两个时间点分别对应胎盘中造血干细胞（HSC）开始出现以及HSC数量达到峰值的发育阶段。此外，我们还提供了一种优化后的方案，通过酶消化和机械解离将胎盘组织制备成单细胞悬液，用于流式细胞术或功能分析。我们发现，使用胶原酶处理胎盘组织以获得单细胞悬液，能够获得足够数量的HSC。影响胎盘来源HSC产量的重要因素包括酶处理前的机械解离程度以及酶消化的持续时间。
我们还提供了一种制备固定冷冻胎盘组织切片的方案，用于通过免疫组织化学方法在其精确的细胞微环境中可视化发育中的造血干细胞（HSCs）。由于造血特异性抗原在制备石蜡包埋切片过程中无法得以保存，我们常规使用固定冷冻切片来定位胎盘中的造血干细胞及其前体细胞。
方案
1. 胚胎取出与胎盘分离
- 首先，必须从怀孕的母鼠中分离胚胎。
- 按照批准的程序对动物实施安乐死——在本实验中，我们将使用致死剂量的异氟烷麻醉剂。
- 首先用乙醇喷洒腹部，并用剪刀做一小切口。
- 用手撕开皮肤以暴露腹腔，然后切开腹膜。
- 用镊子夹起子宫角，并在远端两端用剪刀剪下。将子宫角放入盛有PBS的培养皿中，并置于冰上。同时，请记得在分离胎盘前用PBS多次清洗。现在我们可以开始分离胎盘。
- 使用两把镊子，小心地剥离围绕胚胎胚体的子宫内膜组织。操作时应避免刺破或造成胚胎结构损伤，否则会影响后续的解剖步骤。
- 将分离出的胚体放入盛有PBS并置于冰上的新培养皿中，重复操作直至所有胚体均从子宫内膜中分离完毕。
- 将一个胚体转移至显微镜下盛有PBS的新培养皿中，用两把镊子将蜕膜从胎盘上剥离。应尽可能去除全部蜕膜组织，因为蜕膜细胞会干扰单细胞悬液的制备和流式细胞术分析。建议采用平滑连续的剥离动作以获得最佳效果。
- 在卵黄囊与胎盘连接处将其剪断，并轻轻将卵黄囊及其卵黄血管从胎盘上拉离。操作时应注意不要破坏胎盘的绒毛膜板，尤其是早期胚胎。
- 用一把镊子小心夹住胎盘的绒毛膜板，另一把镊子夹住脐带，将脐带及其连接的胚胎从胎盘上拉离。
- 去除胎盘边缘多余的巨细胞组织，以尽量减少单细胞悬液制备过程中的细胞聚集。
- 将胎盘收集至合适的容器（如15 ml Falco....
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讨论
本实验方案中描述的实验步骤可用于胎盘组织及造血干细胞与祖细胞的分离与观察。有关在整个胎儿发育过程中胎盘及其他胎儿造血器官中预期的细胞产量和造血干细胞数量的全面总结，请参见 Gekas 等人 2005 年的研究。有关造血干细胞及其他造血细胞在胎盘中的定位，请参见 Rhodes 等人 2008 年的研究。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mM 葡萄糖 | |||
| 10 mM NaN3 | |||
| 15 ml 锥形管（BD） | |||
| 16 号、18 号、20 号、22 号和 25 号针头（BD） | |||
| 30% 蔗糖溶液 | |||
| 35 mm 培养皿（BD） | |||
| 4% 多聚甲醛 | |||
| 50 µm 细胞滤网（Celltrics） | |||
| 5 ml 注射器（BD） | |||
| 碱性磷酸酶底物试剂盒 I（Vector Red，Vector） | |||
| 碱性磷酸酶底物试剂盒 III（Vector Blue，Vector） | |||
| 抗生素（青霉素/链霉素，P/S）溶液 | |||
| I 型胶原酶（Sigma） | |||
| 一次性乙烯基标本模具（Cryomold，10 mm × 10 mm × 5 mm，Tissue-Tek） | |||
| 细胞角蛋白一抗（DakoCytomation） | |||
| 解剖镊子，不锈钢或钛制，5 号或 55 号 | |||
| Drierite | |||
| 胎牛血清（FBS） | |||
| Fisherbrand 塑料显微镜载玻片邮寄盒（Fisher） | |||
| 葡萄糖氧化酶 1000 u/ml | |||
| 左旋咪唑（Vector） | |||
| 封片介质，水性封片介质（VectamountTM AQ） | |||
| 正常马血清（Vector） | |||
| 最佳切割温度（O.C.T.，Tissue-Tek） | |||
| 过氧化物酶底物试剂盒 DAB（Vector） | |||
| 含钙/镁的磷酸盐缓冲液（PBS w Ca²⁺/Mg²⁺） | |||
| 不含钙/镁的磷酸盐缓冲液（PBS w/o Ca²⁺/Mg²⁺） | |||
| 塑料载玻片盒（可容纳 100 张载玻片） | |||
| 塑料管路（Nalgene 180 PVC 无毒可高压灭菌） | |||
| 聚丙烯圆底试管，5 ml（12×75 mm，BD Falcon） | |||
| 蛋白酶 K 溶液 20 mg/ml（Amresco） | |||
| Research Products International Corp Super Pap Pen HT* 载玻片标记笔（2.5 mm，Fisher） | |||
| 组织培养处理的 U 型（圆底）96 孔或 24 孔板（BD Falcon） | |||
| Tween20，SigmaUltra（Sigma） | |||
| 酪胺信号放大试剂盒（Invitrogen） | |||
| Vectastain ABC 碱性磷酸酶标准试剂盒（Vector） | |||
| Vectastain ABC 标准 Elite 试剂盒（Vector） |
参考文献
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A.
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