从胎盘中分离和分析造血干细胞

摘要

我们已确定胎盘是发育过程中的主要造血器官。研究发现，造血干细胞（HSCs）在胎盘内独特的微环境生态位中生成并扩增。本文描述了从小鼠胎盘中分离和可视化造血干细胞所需的实验技术。

摘要

造血干细胞（HSCs）具有自我更新的能力，并能在个体整个生命周期中产生所有类型的血细胞。所有HSCs均在胚胎发育过程中产生，此后其细胞池数量通过自我更新的细胞分裂得以维持。由于在胎儿造血过程中有多个解剖位点参与，识别HSCs的解剖起源以及调控HSC发育过程的关键发育事件一直较为复杂。最近，我们发现胎盘是一个重要的造血器官，HSCs在其中独特的微环境生态位中生成并扩增（Gekas等，2005；Rhodes等，2008）。因此，胎盘在HSCs的出现及其初始扩增阶段是一个重要的HSCs来源。

本文介绍了从E10.5和E12.5小鼠胚胎中分离胎盘的解剖技术，这两个时间点分别对应胎盘中造血干细胞（HSC）开始出现以及HSC数量达到峰值的发育阶段。此外，我们还提供了一种优化后的方案，通过酶消化和机械解离将胎盘组织制备成单细胞悬液，用于流式细胞术或功能分析。我们发现，使用胶原酶处理胎盘组织以获得单细胞悬液，能够获得足够数量的HSC。影响胎盘来源HSC产量的重要因素包括酶处理前的机械解离程度以及酶消化的持续时间。

我们还提供了一种制备固定冷冻胎盘组织切片的方案，用于通过免疫组织化学方法在其精确的细胞微环境中可视化发育中的造血干细胞（HSCs）。由于造血特异性抗原在制备石蜡包埋切片过程中无法得以保存，我们常规使用固定冷冻切片来定位胎盘中的造血干细胞及其前体细胞。

方案

1. 胚胎取出与胎盘分离

1. 首先，必须从怀孕的母鼠中分离胚胎。
2. 按照批准的程序对动物实施安乐死——在本实验中，我们将使用致死剂量的异氟烷麻醉剂。
3. 首先用乙醇喷洒腹部，并用剪刀做一小切口。
4. 用手撕开皮肤以暴露腹腔，然后切开腹膜。
5. 用镊子夹起子宫角，并在远端两端用剪刀剪下。将子宫角放入盛有PBS的培养皿中，并置于冰上。同时，请记得在分离胎盘前用PBS多次清洗。现在我们可以开始分离胎盘。
6. 使用两把镊子，小心地剥离围绕胚胎胚体的子宫内膜组织。操作时应避免刺破或造成胚胎结构损伤，否则会影响后续的解剖步骤。
7. 将分离出的胚体放入盛有PBS并置于冰上的新培养皿中，重复操作直至所有胚体均从子宫内膜中分离完毕。
8. 将一个胚体转移至显微镜下盛有PBS的新培养皿中，用两把镊子将蜕膜从胎盘上剥离。应尽可能去除全部蜕膜组织，因为蜕膜细胞会干扰单细胞悬液的制备和流式细胞术分析。建议采用平滑连续的剥离动作以获得最佳效果。
9. 在卵黄囊与胎盘连接处将其剪断，并轻轻将卵黄囊及其卵黄血管从胎盘上拉离。操作时应注意不要破坏胎盘的绒毛膜板，尤其是早期胚胎。
10. 用一把镊子小心夹住胎盘的绒毛膜板，另一把镊子夹住脐带，将脐带及其连接的胚胎从胎盘上拉离。
11. 去除胎盘边缘多余的巨细胞组织，以尽量减少单细胞悬液制备过程中的细胞聚集。
12. 将胎盘收集至合适的容器（如15 ml Falcon管）中，加入PBS+5%FCS，并置于冰上。对所有解剖得到的胎盘均进行相同处理。
13. 至此，您可以选择继续制备单细胞悬液用于流式细胞术、功能实验（如体外培养或移植），或对完整胎盘进行组织固定及冷冻包埋，以便后续进行免疫组织化学分析。

2. 胎盘组织单细胞悬液的制备

1. 现在我们将向您展示如何从胎盘制备单细胞悬液，用于流式细胞术（FACS）分析。
2. 为了从胎盘制备单细胞悬液，需要进行机械和酶解离。首先在PBS中配制含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素溶液的0.1%胶原酶溶液。
3. 根据胎盘的数量加入适量的胶原酶溶液，建议体积为胎盘体积的两倍，且在2–5 ml之间。
4. 使用安装在5 ml注射器上的16号针头，将胶原酶溶液和胎盘组织反复通过针头3次，以进行机械破碎。随后用18号针头重复此操作。
5. 将样品置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育45分钟。
6. 在胶原酶中孵育45分钟后，将细胞悬液通过20号针头吹打一次，并在37°C下继续孵育额外45分钟。
7. 在胶原酶中总孵育时间为1.5小时后，分别使用22号和25号针头，各将细胞悬液吹打3次。
8. 将样品通过连接在新的15 ml Falcon管上的50 µm滤膜过滤，用含5% FCS的PBS洗涤，并在4°C下以300 × g离心5分钟。
9. 至此，我们已获得适用于流式细胞术分析或功能实验的单细胞悬液。

3. 冷冻切片的组织固定

1. 从每个胚胎中分离出胎盘后，立即将其置于冰冷的1×PBS中。通常，96孔板最适合较年轻的胎盘（E8.5–11.5），而对于较年老的胎盘（E12.5及以上），使用24孔板可能更为方便。
2. 将每个胎盘转移至装有新解冻的4%多聚甲醛（PFA）的新孔中。对于E12.5的胎盘，需手动将组织转移至新孔；而对于E10.5的胎盘，可小心用移液器吸除PBS后直接加入PFA。根据组织的年龄和大小，胎盘必须在4°C下完全浸没于固定液中2–4小时。
3. 将组织转移至30%蔗糖溶液中；若组织非常小且脆弱，可直接吸除PFA后加入蔗糖溶液。在此阶段，胎盘会漂浮在溶液中。于4°C下静置过夜。
4. 在30%蔗糖溶液中过夜后，组织应最终沉降至孔底，表明已实现良好的冷冻保护。吸除一半蔗糖溶液，等体积替换为OCT包埋剂，并将组织重新置于4°C环境中1–2小时，以促进OCT充分渗透。
5. 将组织转移至100% OCT中1小时，随后即可进行包埋。

4. 包埋固定组织

1. 用适当的组织标识标记塑料模具（展示示例模具）。
2. 将组织从OCT溶液中取出，通过将盘状胎盘脐带侧朝下放置，并用洁净的刀片小心切割，将胎盘切成两半；切割时需前后移动刀片，待完全切透后再抬起刀片，以确保切面平整。将胎盘切成两半是为了获得最佳取向，以便后续观察胎盘造血干细胞（HSCs）。
3. 将一半胎盘放入模具底部，使切面紧贴模具底面。另一半胎盘使用新的模具重复此操作。对于E10.5胎盘，可使用相同方法将两半均放入同一模具中。
4. 向模具中倒入OCT时，可能难以保持胎盘的正确方向。可用镊子夹住组织半片以固定胎盘位置，然后缓慢倒入OCT溶液，避免产生气泡。对于E10.5胎盘，用镊子夹住其中一半组织，另一半则靠在镊子外侧进行支撑，随后按照E12.5胎盘的方法缓慢倒入OCT溶液。
5. 当模具充满OCT后，迅速将模具置于干冰上，OCT会变白，实现组织的速冻。
6. 将模具放入装有干燥剂（Drierite）的小塑料袋中，并立即储存于-80°C冰箱中。

讨论

本实验方案中描述的实验步骤可用于胎盘组织及造血干细胞与祖细胞的分离与观察。有关在整个胎儿发育过程中胎盘及其他胎儿造血器官中预期的细胞产量和造血干细胞数量的全面总结，请参见 Gekas 等人 2005 年的研究。有关造血干细胞及其他造血细胞在胎盘中的定位，请参见 Rhodes 等人 2008 年的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mM 葡萄糖
10 mM NaN3
15 ml 锥形管（BD）
16 号、18 号、20 号、22 号和 25 号针头（BD）
30% 蔗糖溶液
35 mm 培养皿（BD）
4% 多聚甲醛
50 µm 细胞滤网（Celltrics）
5 ml 注射器（BD）
碱性磷酸酶底物试剂盒 I（Vector Red，Vector）
碱性磷酸酶底物试剂盒 III（Vector Blue，Vector）
抗生素（青霉素/链霉素，P/S）溶液
I 型胶原酶（Sigma）
一次性乙烯基标本模具（Cryomold，10 mm × 10 mm × 5 mm，Tissue-Tek）
细胞角蛋白一抗（DakoCytomation）
解剖镊子，不锈钢或钛制，5 号或 55 号
Drierite
胎牛血清（FBS）
Fisherbrand 塑料显微镜载玻片邮寄盒（Fisher）
葡萄糖氧化酶 1000 u/ml
左旋咪唑（Vector）
封片介质，水性封片介质（VectamountTM AQ）
正常马血清（Vector）
最佳切割温度（O.C.T.，Tissue-Tek）
过氧化物酶底物试剂盒 DAB（Vector）
含钙/镁的磷酸盐缓冲液（PBS w Ca²⁺/Mg²⁺）
不含钙/镁的磷酸盐缓冲液（PBS w/o Ca²⁺/Mg²⁺）
塑料载玻片盒（可容纳 100 张载玻片）
塑料管路（Nalgene 180 PVC 无毒可高压灭菌）
聚丙烯圆底试管，5 ml（12×75 mm，BD Falcon）
蛋白酶 K 溶液 20 mg/ml（Amresco）
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* 载玻片标记笔（2.5 mm，Fisher）
组织培养处理的 U 型（圆底）96 孔或 24 孔板（BD Falcon）
Tween20，SigmaUltra（Sigma）
酪胺信号放大试剂盒（Invitrogen）
Vectastain ABC 碱性磷酸酶标准试剂盒（Vector）
Vectastain ABC 标准 Elite 试剂盒（Vector）