中性粒细胞分离方案

摘要

中性粒细胞是炎症免疫反应发生时最早到达反应部位的细胞之一，其功能和作用机制已在体外得到广泛研究。本文展示了一种标准的密度梯度分离方法，利用 commercially available 分离介质从全血中分离人中性粒细胞。

摘要

中性粒细胞（多形核粒细胞，PMN）是人体内最丰富的白细胞，也是炎症免疫反应发生时最早抵达反应部位的细胞之一。由于其在炎症过程中的关键作用，中性粒细胞的多种功能，如运动性、细胞因子产生、吞噬作用以及对肿瘤细胞的杀伤能力，均被广泛研究。为了体外研究中准确表征中性粒细胞的特定功能，亟需一种纯净、快速且可靠的分离方法，以将其与其他血细胞分离开来，尤其因为中性粒细胞寿命较短，采集后应在2–4小时内使用。本文展示了一种标准的密度梯度离心法，利用市售的分离介质（由甲泛影酸钠与右旋糖酐500组成）从全血中分离人中性粒细胞。该方法包括将全血叠加于密度梯度介质上、离心、收集中性粒细胞层以及裂解残留红细胞。随后对细胞进行洗涤、计数，并重悬于缓冲液中至所需浓度。若操作正确，该方法可获得纯度超过95%、活力高于95%的中性粒细胞样本。 关键词：中性粒细胞，多形核粒细胞，PMN，密度梯度离心，细胞分离，全血，甲泛影酸钠，右旋糖酐500，细胞活力，细胞纯度

方案

 中性粒细胞分离方案

1. 将所有试剂恢复至室温。
2. 在离心管中加入 5.0 ml 中性粒细胞分离介质。小心地将 5.0 ml 血液缓慢铺加在分离介质上方。操作时应缓慢且轻柔，移液器吸头应靠近介质表面，以避免血液与介质混合。
3. 在 20–25°C 条件下，以 500 RCF 离心 35 分钟。血液应分为 6 个清晰的条带：血浆、单核细胞、分离介质、中性粒细胞、更多的分离介质以及红细胞沉淀（图 1）。如果条带不清晰，说明分离过程不彻底，需重复该步骤。
4. 使用移液器小心移除最上层的三层（血浆、单核细胞和分离介质），并弃去。
5. 小心吸取中性粒细胞层以及其下方全部的分离介质，将溶液转移至一支干净的离心管中。
6. 用不含 Ca²+/Mg²+ 的 HBSS 将中性粒细胞悬液稀释至 10 ml。轻轻颠倒混匀数次，使细胞充分悬浮。
7. 以 350 RCF 离心 10 分钟。管底应出现红色沉淀，其中含有中性粒细胞及残留的红细胞（RBCs）。小心用移液器吸除上清液，避免扰动沉淀。
8. 为裂解残留的红细胞，向管中加入 2 ml 红细胞裂解缓冲液。为重悬沉淀，将管在涡旋振荡器上以 3–4 档涡旋。避免将涡旋档位调至 4 以上，以免激活中性粒细胞。可能需要涡旋数秒，或采用“脉冲”方式涡旋以充分溶解沉淀。
9. 以 250 RCF 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液。如有需要，可重复裂解步骤。
10. 向每支管中加入 500 μl 不含 Ca²+/Mg²+ 的 HBSS。再次以 3–4 档涡旋重悬沉淀。然后用不含 Ca²+/Mg²+ 的 HBSS 稀释至 10 ml。
11. 以 250 RCF 离心 5 分钟。吸除上清液并弃去。
12. 将沉淀重悬于 250 μl HBSS/HSA 溶液（2% HSA）中。随后可对细胞进行计数，并调整至所需浓度。

 

讨论

密度梯度分离法利用偏重酸钠和右旋糖酐500的混合物从全血中分离人中性粒细胞。该方法基于Boyum（1968年）提出的单个核白细胞分离法，并由Ferrante和Thong（1980年）针对中性粒细胞分离进行了改良。

从供体采集全血后，可用EDTA、柠檬酸盐或肝素进行抗凝处理。由于中性粒细胞寿命较短，应在采集后2-4小时内使用。该操作步骤包括将全血叠加于密度梯度介质上，离心，分离中性粒细胞层，以及裂解残留的红细胞。随后将细胞洗涤、计数，并重悬至所需浓度。

如果第一次离心后未出现清晰的六条带，则说明分离过程不彻底，需要重复操作。为获得清晰的分离效果，请确保分离介质未过期且未被污染。若献血者在采血前72小时内摄入过酒精或药物，也可能导致分离失败。

为防止中性粒细胞在分离过程中被激活，最好使用不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 HBSS，因为这些离子已被证明可使细胞致敏。沉淀物的重悬操作也应缓慢进行，涡旋振荡的设置应保持在低至中等范围，以避免细胞被激活。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
淋巴细胞分离液 Poly(R)	试剂	Cedarlane Labs		可使用 PolymorphprepTM 作为替代
不含氯化钙的 Hank’s 平衡盐溶液	试剂	Invitrogen
人血清白蛋白	试剂	ZLB Bioplasma
红细胞裂解缓冲液	试剂	Roche Group
离心机	工具
涡旋振荡器	工具
巴斯德吸管及吸头	工具
PolymorphprepTM	试剂	Axis-Shield		淋巴细胞分离液 Poly(R) 的替代试剂
注射器滤器	其他	EMD Millipore	SLGV033RS	Millex-GV，0.22 μm，PVDF，33 mm，可伽马射线灭菌
含氯化钙的 Hank’s 平衡盐溶液	试剂	Invitrogen