视网膜切片中光诱发的全细胞兴奋性突触电流记录

摘要

本视频展示了在水生虎纹蝾螈视网膜切片中进行全细胞电压钳记录的过程。我们演示了切片的制备方法，以及在视网膜接受视觉刺激期间如何进行膜片钳记录。

摘要

我们采用全细胞膜片钳技术研究视网膜中视觉信息处理所依赖的突触环路。本视频将指导您完成视网膜切片制备中单个细胞光诱导电流的全细胞记录操作。实验以水生虎纹蝾螈作为动物模型。首先介绍眼球的解剖过程，并展示如何将切片固定以进行电生理记录。当切片置于记录浴槽后，我们将演示如何实施全细胞电压钳记录。随后，向切片中的光感受器投射视觉刺激，以诱发光反应性电流。记录过程中，通过药理学试剂灌流切片，八通道灌流系统可实现不同试剂间的快速切换。视网膜切片制备被广泛应用于视网膜膜片钳记录，尤其适用于在整体铺片制备中难以触及的无长突细胞或双极细胞的研究。 全细胞膜片钳, 视网膜, 突触环路, 视觉信息处理, 光诱导电流, 视网膜切片, 虎纹蝾螈, 电生理记录, 电压钳, 视觉刺激, 药理学灌流, 八通道灌流系统, 无长突细胞, 双极细胞, 整体铺片

方案

 溶液

• 视网膜节细胞内液（单位：mM）：100 K-葡萄糖酸盐，8 KCl，1 MgCl₂，1 EGTA，10 HEPES，4 ATP，0.5 GTP，90 µM 硫罗丹明 B（用于染色），用 KOH 调节 pH 至 7.4
• 视网膜双极细胞内液（单位：mM）：90 K-葡萄糖酸盐，8 KCl，1 MgCl₂，10 BAPTA，10 HEPES，4 ATP，0.5 GTP，90 µM 硫罗丹明  B（用于染色），用 KOH 调节 pH 至 7.4
• 细胞外 Ringer 溶液（单位：mM）：112 NaCl，5 葡萄糖，5 HEPES，2 KCl，2 CaCl₂，1 MgCl₂，用 NaOH 调节 pH 至 7.75。该溶液无需通氧。

准备记录室

我们的记录室由一个载玻片构成，载玻片上带有粘附性凹槽，凹槽内放置从另一个粘附性凹槽切割而成的小型硅胶块，以提供组织切片的稳定性。

视网膜切片的制备

为避免感光细胞漂白，解剖应在红外光或暗红光下进行。如果需要记录视杆细胞通路的反应，则只能使用红外光（使用配备红外目镜的解剖显微镜，且关闭室内光源。对于不在显微镜下进行的操作，还应额外佩戴红外护目镜）。如果主要关注记录视锥细胞的光反应，则可使用暗红光照明的室内光源或红色手电筒。但显微镜仍应配备红外目镜。

如果光感受器输入对实验无关紧要，则可在普通室内光线下使用常规显微镜进行操作。

1. 准备两张带有粘性硅胶小室的显微镜载玻片：在每张载玻片上制作两条平行的硅脂带（间距约0.5 cm），并在载玻片的一侧放置一片矩形滤纸，使其横跨两条硅脂带（用剃刀片的一部分轻压滤纸，确保其牢固贴附于载玻片）
2. 根据既定方案处死蝾螈：将动物置于冰浴中30分钟，随后进行断头并双次穿刺脊髓
3. 从蝾螈头部取出眼球，并将其置于解剖显微镜下，放置在用冰冻冷Ringer液润湿的组织纸上
4. 去除眼球周围的结缔组织
5. 使用剃刀片在角膜上做一个小切口
6. 用镊子夹住切开的角膜，同时沿其与眼球的附着处用剪刀将其剪除
7. 用镊子取出晶状体
8. 用镊子夹住虹膜，并沿锯齿缘剪开以去除虹膜
9. 将眼杯切成两块矩形组织片
10. 取其中一块组织片，将其巩膜面朝上放置在滤纸上（确保在轻轻下压时将其展平）
11. 轻柔地将巩膜从视网膜上剥离，此时视网膜应仍附着在滤纸上
12. 迅速向小室内加入冰冻冷的Ringer液
13. 对第二块组织片重复相同操作
14. 使用安装在自制切片器中的剃刀片切割成200–300 µm宽的切片
15. 用一对镊子从滤纸边缘夹起切片，将其翻转，使视网膜各层可见，然后将其放置在真空硅脂带上
16. 选择一张外观无损伤且显示水平条带（代表视网膜各层）的切片（在解剖显微镜下有时难以看清各层，因为放大倍数不足；但若能辨认出部分层状结构，通常表明切片质量足够好。是否使用该切片的最终决定需在直立显微镜下观察后作出）。通过在两张载玻片之间建立Ringer液桥，将切片转移至记录室载玻片
17. 确保滤纸紧贴记录室中的橡胶块，使切片不倾斜（应能同时聚焦到神经节细胞和光感受器）

将组织放置于记录装置中

1. 将记录玻片置于显微镜下，并通过重力灌流系统用任氏液进行灌流。
2. 使用配备10倍和40倍水浸物镜的直立显微镜观察标本。
3. 同样，我们仅使用红外光以防止感光细胞漂白。显微镜侧端口连接一台红外摄像机，并与电视屏幕相连。

视觉刺激

视觉刺激使用Matlab中的Psychtoolbox程序生成，并通过显微镜顶部接口利用显微图像注入器（Mbf Bioscience）投射到视网膜上。采用Bits++数字视频处理器（Cambridge Research Systems）实现14位灰度等级，并同步刺激呈现与数据采集过程。本视频中使用的视觉刺激为高对比度（100%）的亮条或暗条（宽度 = 460 µm），在恒定均匀背景（亮度 = 8 × 10⁴ 光子/µm/s，尺寸：1.84 × 1.38 mm）上呈现，每刺激持续2秒。

电生理学

• 采用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃管（外径：1.5 mm，内径：0.84 mm）中拉制膜片钳电极。记录神经节细胞时，电极阻抗为 2 至 4 MΩ；记录双极细胞时，使用较高阻抗，为 4 至 8 MΩ。
• 电压钳记录使用 Multiclamp 700A（Molecular Devices）放大器及基于 Labview 编程的实验室内部软件进行。
• 药物通过八通道灌流系统进行灌注。微灌流电极应放置于脑片附近（开启和关闭灌流时应可见组织轻微移动），但需注意避免压力过大，以防脑片从滤纸上脱落。实验过程中应始终保持微灌流开启状态（若无需给药，则灌注对照溶液），以避免因频繁开关灌流而干扰记录。

讨论

优点：

1. 所有细胞类型均可触及
   
2. 易于识别细胞类型，特别是当向电极液中添加荧光染料时
   
3. 药理学试剂可轻松到达靶细胞
   
4. 膜片钳技术可用于研究不同离子通道在视网膜计算中的作用。这些信息无法通过细胞外锋电位记录或尖锐电极记录获得。
   
5. 该技术可应用于其他动物模型
   

缺点：

1. 在切片过程中，神经突可能被切断。因此，针对空间感受野的研究可能会面临困难。
   
2. 与大多数用于电生理记录的离体视网膜制备方法一样，色素上皮已被去除，这可能导致感光细胞褪色。需要高强度光刺激或需在多种适应状态下研究视网膜的实验可能在此技术中遇到困难。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Multiclamp 700A	膜片钳放大器	Molecular Devices
SZX9	解剖显微镜	Olympus Corporation
BX50WI	直立显微镜	Olympus Corporation		配备40x、10x水浸物镜、荧光滤光片和汞灯
P-97	微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.
Lucivid	显微镜图像注入器	MBF Bioscience
8通道灌流系统	微灌流系统	Parker Hannifin Corporation
Bits++	数字视频处理器	Cambridge Research Systems
Infrared Oculars	其他	ITT Visual Information Solutions
粘性硅胶小室	其他	Molecular Probes, Life Technologies		直径20mm，深度1.0mm
膜过滤器	过滤器	EMD Millipore	HAWPO1300	.45μm HA
硼硅酸盐玻璃毛细管	电极玻璃管	World Precision Instruments, Inc.	1B150-4
注射器过滤器	过滤器	Whatman, GE Healthcare	6789-0402	4mm过滤器，.2μm尼龙膜，聚丙烯外壳
红外摄像机	显微镜载物摄像机	Sony Corporation	SPT-M324	Extrawave HAD，B7W视频摄像机
苦味毒	试剂	Sigma-Aldrich	P1675
士的宁	试剂	Sigma-Aldrich	S0532
咪唑-4-乙酸钠盐	试剂	Sigma-Aldrich	I7013
幼体虎纹蝾螈	实验动物	Charles E. Sullivan