视网膜切片中光诱发的全细胞兴奋性突触电流记录

摘要

本视频展示了在水生虎纹蝾螈视网膜切片中进行全细胞电压钳记录的过程。我们演示了切片的制备方法，以及在视网膜接受视觉刺激期间如何进行膜片钳记录。

摘要

我们采用全细胞膜片钳技术研究视网膜中视觉信息处理所依赖的突触环路。本视频将指导您完成视网膜切片制备中单个细胞光诱导电流的全细胞记录操作。实验以水生虎纹蝾螈作为动物模型。首先介绍眼球的解剖过程，并展示如何将切片固定以进行电生理记录。当切片置于记录浴槽后，我们将演示如何实施全细胞电压钳记录。随后，向切片中的光感受器投射视觉刺激，以诱发光反应性电流。记录过程中，通过药理学试剂灌流切片，八通道灌流系统可实现不同试剂间的快速切换。视网膜切片制备被广泛应用于视网膜膜片钳记录，尤其适用于在整体铺片制备中难以触及的无长突细胞或双极细胞的研究。 全细胞膜片钳, 视网膜, 突触环路, 视觉信息处理, 光诱导电流, 视网膜切片, 虎纹蝾螈, 电生理记录, 电压钳, 视觉刺激, 药理学灌流, 八通道灌流系统, 无长突细胞, 双极细胞, 整体铺片

方案

 溶液

• 视网膜节细胞内液（单位：mM）：100 K-葡萄糖酸盐，8 KCl，1 MgCl₂，1 EGTA，10 HEPES，4 ATP，0.5 GTP，90 µM 硫罗丹明 B（用于染色），用 KOH 调节 pH 至 7.4
• 视网膜双极细胞内液（单位：mM）：90 K-葡萄糖酸盐，8 KCl，1 MgCl₂，10 BAPTA，10 HEPES，4 ATP，0.5 GTP，90 µM 硫罗丹明  B（用于染色），用 KOH 调节 pH 至 7.4
• 细胞外 Ringer 溶液（单位：mM）：112 NaCl，5 葡萄糖，5 HEPES，2 KCl，2 CaCl₂，1 MgCl₂，用 NaOH 调节 pH 至 7.75。该溶液无需通氧。

准备记录室

我们的记录室由一个载玻片构成，载玻片上带有粘附性凹槽，凹槽内放置从另一个粘附性凹槽切割而成的小型硅胶块，以提供组织切片的稳定性。

视网膜切片的制备

为避免感光细胞漂白，解剖应在红外光或暗红光下进行。如果需要记录视杆细胞通路的反应，则只能使用红外光（使用配备红外目镜的解剖显微镜，且关闭室内光源。对于不在显....

讨论

优点：

1. 所有细胞类型均可触及
   
2. 易于识别细胞类型，特别是当向电极液中添加荧光染料时
   
3. 药理学试剂可轻松到达靶细胞
   
4. 膜片钳技术可用于研究不同离子通道在视网膜计算中的作用。这些信息无法通过细胞外锋电位记录或尖锐电极记录获得。
   
5. 该技术可应用于其他动物模型
   

缺点：

1. 在切片过程中，神经突可能被切断。因此，针对空间感受野的研究可能会面临困难。
   
2. 与大多数用于电生理记录的离体视网膜制备方法一样，色素上皮已被去除，这可能导致感光细胞褪色。需要高强度光刺激或需在多种适应状态下研究视网膜的实验可能在此技术中遇到困难。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Multiclamp 700A	膜片钳放大器	Molecular Devices
SZX9	解剖显微镜	Olympus Corporation
BX50WI	直立显微镜	Olympus Corporation		配备40x、10x水浸物镜、荧光滤光片和汞灯
P-97	微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.
Lucivid	显微镜图像注入器	MBF Bioscience
8通道灌流系统	微灌流系统	Parker Hannifin Corporation
Bits++	数字视频处理器	Cambridge Research Systems
Infrared Oculars	其他	ITT Visual Information Solutions
粘性硅胶小室	其他	Molecular Probes, Life Technologies		直径20mm，深度1.0mm
膜过滤器	过滤器	EMD Millipore	HAWPO1300	.45μm HA
硼硅酸盐玻璃毛细管	电极玻璃管	World Precision Instruments, Inc.	1B150-4
注射器过滤器	过滤器	Whatman, GE Healthcare	6789-0402	4mm过滤器，.2μm尼龙膜，聚丙烯外壳
红外摄像机	显微镜载物摄像机	Sony Corporation	SPT-M324	Extrawave HAD，B7W视频摄像机
苦味毒	试剂	Sigma-Aldrich	P1675
士的宁	试剂	Sigma-Aldrich	S0532
咪唑-4-乙酸钠盐	试剂	Sigma-Aldrich	I7013
幼体虎纹蝾螈	实验动物	Charles E. Sullivan