小鼠表皮神经嵴干细胞（EPI-NCSC）培养

摘要

本文介绍了我们分离小鼠表皮神经嵴干细胞（EPI-NCSC）的方法。该技术包括显微解剖小鼠须毛毛囊，分离毛囊隆突区，并将其置于组织培养环境中。EPI-NCSC 通常在 3 至 4 天内开始从隆突区外植块迁移至培养基质表面。

摘要

EPI-NCSC 是存在于成体毛囊隆突区的胚胎神经嵴残余细胞。它们是一类多能干细胞，具有生成多种分化细胞类型的生理特性，包括神经元、神经支持细胞、平滑肌细胞、骨/软骨细胞以及黑色素细胞。EPI-NCSC 易于从有毛皮肤获取，并可分离为高纯度的干细胞群体。本视频详细展示了从小鼠胡须毛囊制备 EPI-NCSC 培养物的实验方案。取成年小鼠的胡须垫组织，解剖分离出胡须毛囊；将毛囊在隆突区域上下纵向切开，再作横向切割；取出隆突区的细胞，脱离胶原囊后置于培养板中。3 至 4 天后，EPI-NCSC 开始从隆突外植体迁移出来。

方案

成年小鼠胡须毛囊隆突区的分离

1. 我们使用 10 周至 6 个月大的小鼠。较年轻的小鼠通常能获得更多的细胞。处死小鼠后，将整个动物浸入 1:1 的聚维酮碘（碘溶液）与过氧化氢（可从药店获得）混合液中，约 3 分钟。
   
2. 用 75% 乙醇喷洒整个小鼠，尤其是面部区域，然后将小鼠转移至层流罩内的解剖显微镜下操作。
3. 解剖分离胡须垫组织，注意避免切到毛囊球，并将组织收集至 HBSS 中。
4. 在室温下解剖胡须毛囊并收集至 HBSS 中。操作时用镊子夹住毛囊旁的皮肤，用直头剪刀围绕毛囊进行剪切。剪切时应较深，以避免损伤毛囊球。
5. 将胡须毛囊从胡须垫中取出，放入含有新鲜 HBSS 的新培养皿中。
6. 用缓冲液反复冲洗，去除松散的脂肪和真皮组织，直至胡须毛囊清洁。如有必要，切断通向毛囊的神经，并通过刮除及重复冲洗 HBSS 去除附着的组织。
7. 使用 sharpened tungsten 针将清洁的毛囊固定在 Sylgard 涂层的玻璃培养皿上，用显微镊夹住毛囊旁的皮肤部分以固定。
8. 用显微刀片纵向切开胡须毛囊。注意不要切得太深，以免损伤隆突区（bulge）。用 HBSS 反复冲洗去除血液，直至无血。出现血液是切割深度足够的良好标志。如果纵向切口长度不足，可用弯头显微剪刀延长切口。
9. 在海绵窦水平以上做一横向切口，随后在靠近皮肤的环窦水平处做第二道横向切口。
10. 此时可在毛囊囊内观察到隆突区（bulge）。
11. 用镊子夹住胶原囊的一端，用弯头钨针将隆突区向外卷出。此时可见空的囊结构和分离出的隆突区。
12. 将分离出的隆突区收集至另一含有 HBSS 的培养皿中，室温保存。确保收集的隆突区中无其他组织污染。

隆起区外植体的培养

1. 用胶原蛋白包被35 mm培养皿：将50 µl胶原蛋白和10 µl无菌6% NaCl并排加入培养皿中，使用双弯巴斯德吸管充分混合，并将液体推向培养皿边缘。在洁净的干燥器中孵育过夜，但不要使其干燥。使用前用生理盐水冲洗培养皿。
2. 将包被胶原蛋白并冲洗后的培养皿用培养基预孵育约3小时。培养基由85% α-修饰最低必需培养基（Alpha-modified MEM）、10%胎牛血清和5%第11天鸡胚提取物组成。
3. 再次孵育后，从培养皿中移除培养基，并加入含尽可能少培养基的毛囊隆突外植体。去除多余的培养基。
4. 在细胞培养箱中，于含10%氧气和5% CO₂的湿润气氛中孵育1小时，不得超过该时间。
5. 1小时后，轻柔加入1.5 ml培养基。隆突外植体应黏附于胶原基质上。每天更换50%的培养基。
6. 在3 – 4天内，高迁移性细胞将从隆突外植体迁移而出。注意其星状形态、运动能力以及细胞间接触的显著缺乏。在随后几天内，将有更多细胞迁移出来，且已迁移的细胞会迅速增殖。
7. 在EPI-NCSC开始迁移后的2 – 3天，使用锋利的钨针移除隆突组织。若隆突组织保留时间过长，其倾向于变平，导致无法获得纯的EPI-NCSC培养物。
8. 重要提示：少数形态扁平的细胞可能在EPI-NCSC出现数天后才显现，且运动性较低，这些细胞不是EPI-NCSC，而是假定的表皮干细胞/前体细胞。由这类细胞构成的培养物，或含有EPI-NCSC与假定表皮干细胞/前体细胞的混合培养物，均应弃用。
9. 提示：不要将细胞在初级外植体培养基中维持过长时间，因为在高细胞密度下，细胞倾向于快速分化，可能与自分泌/旁分泌生长因子信号有关。

讨论

由于具有迁移能力，EPI-NCSC 可被分离为高纯度的干细胞群体，并可在体外进行扩增。作为存在于成体部位的胚胎残留细胞，EPI-NCSC 在未来的细胞替代治疗、生物医学工程和/或再生医学中具有潜在的应用前景。我们已在脊髓损伤的小鼠模型中测试了 EPI-NCSC，结果显示其具备理想的特性。通过 LongSAGE 基因表达谱分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，系列编号 GSE4680）发现，正如预期，胚胎神经嵴细胞与 EPI-NCSC 具有相似的基因表达模式，而该模式不同于邻近的表皮干细胞及其他皮肤驻留干细胞/前体细胞的表达模式。