从小鼠卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区分离早期造血干细胞

摘要

本视频展示了如何从胚胎中显微解剖卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区域，并利用流式细胞术分选造血干细胞。

摘要

在小鼠胚胎中，早期造血过程同时发生在多个器官，包括卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区。这些区域对于胚胎血液系统的建立至关重要，并最终促使干细胞迁移至胎肝，随后在骨髓中发育为成体造血干细胞。早期造血干细胞可通过胚胎显微解剖结合流式细胞术分选获得，以得到更纯的细胞群体。目前尚不清楚这些干细胞群体如何贡献于胎儿及成体干细胞库。此外，本实验室致力于研究早期干细胞在功能上如何区别于胎儿和成体造血干细胞。同时，我们对不同群体的造血干细胞进行分选，并在多种遗传模型背景下检测其功能作用。在本视频中，我们展示了常用的显微解剖操作流程，并呈现典型的流式细胞术分选结果。在成功分离这些稀有细胞群体后，可开展多种功能分析实验，包括集落形成实验和骨髓移植实验。

方案

从小鼠卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区域分离早期造血干细胞

1. 开始之前，必须准备好实验所需的所有试剂和工具：
   
   • 剪刀
   • 4号镊子，以及5/45号外科级弯头镊子（可选）
   • 带注射器的30号针头
   • 35 mm 和100 mm培养皿
   • 含10%和20%胎牛血清的PBS
   • 最后是胶原酶
2. 开始解剖时，需从妊娠10.5天的雌性小鼠体内取出子宫角。
3. 动物按照批准的程序实施安乐死。 我们采用二氧化碳窒息法，随后进行颈椎脱位。
4. 用乙醇润湿雌鼠腹部，用剪刀切开皮肤。
5. 用镊子夹住皮肤，进一步剪开腹膜。
6. 打开腹腔后可观察到子宫角。用镊子固定子宫角，分别剪断远端和中央部位，以切除两侧子宫角。
7. 将子宫角放入含有冷PBS（含10% FBS）的培养皿中，以去除子宫组织。
8. 使用4号镊子并在显微镜下操作，小心地从每个胚胎胚体周围去除子宫内膜组织，注意避免刺破胎盘。
9. 去除后，将胚胎转移至另一新鲜培养皿中，其中含有冷PBS和10% FBS。
10. 小心去除胎盘组织，暴露包裹在卵黄囊中的胚胎：用镊子在胚胎包裹的卵黄囊与胎盘连接处将其剪下。 含有卵黄动脉和部分脐带的卵黄囊可轻轻分离并置于冰上，用于后续解离。
11. 将胚胎转移至一个小型培养皿中，加入极少量含10% FBS的PBS——仅需足够润湿胚胎即可，不宜过多。 最佳液量应使胚胎在缓慢振荡培养皿时保持静止，确保解剖过程中胚胎稳定固定。
12. 换用30号针头，用于切除胚胎的上部和下部，即在前肢上方和后肢下方进行切割。 使用针头作为切割工具需要一定练习才能熟练掌握。 可通过交叉针头进行多次微小切割来分离组织，主手持针作为引导，非主手持针进行切割。 重复进行小切口操作 是确保精确切割位置的关键。
13. 去除胚胎的背侧部分。 这部分组织包含体节。 小心切除外层背侧组织，同时与主动脉（红线）保持足够距离，避免划伤。 若划破主动脉会导致血液流失，难以清晰观察其位置。 同样，使用针头进行微小切割 对于维持精确的切割位置至关重要。
14. 将多余组织推离视野，翻转胚胎以切除腹侧组织，同样尽可能靠近主动脉但不损伤它。 若切割位置距离过远，则会残留腹部组织，这些可在AGM分离后进一步去除。
15. 将胚胎背侧朝下放置，即背部贴紧培养皿。 轻轻压开两侧组织，观察生殖嵴的位置。 生殖嵴位于主动脉两侧略偏离中线处，呈管状结构。 
16. 使用与之前相同的切割技术去除多余的侧边组织，完成解剖。当胚胎一侧组织被去除后，将其翻转过来以去除另一侧残留的组织。
17. 此时检查AGM是否存在可轻易去除的多余组织，但需避免损伤主动脉或性腺。 尽可能去除多余组织有助于更好地分离干细胞群体，因为我们仅依赖少数细胞表面标志物进行纯化。
18. 使用弯头镊子轻轻挑起每个AGM，放入含10% FBS的冷PBS中，待后续解离使用。

解离与流式细胞分析

1. 为解离组织，首先将卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区（AGM）分别放入不同的离心管中。 
2. 短暂离心以沉淀组织，并弃去含10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）。
3. 将组织重悬于含20% FBS的PBS中的0.25%胶原酶溶液中，加入足够体积以充分覆盖组织。
4. 在37摄氏度下孵育组织：AGM孵育25–30分钟，卵黄囊孵育35–40分钟。 
5. 孵育结束后，轻轻吹打组织，使其解离成单细胞悬液。
6. 用过量含10% FBS的PBS洗涤组织，离心收集细胞，并重悬于新鲜无菌的含10% FBS的PBS中。
7. 进行流式细胞术（FACS）分析时，细胞染色按照试剂制造商的建议进行。 我们使用BD Biosciences公司的FACSAria仪器进行流式细胞分析。 由于胚胎细胞体积较大且较为脆弱，分选喷嘴的孔径需设置得比成年造血细胞更大（我们在实验室中也研究成年造血细胞）；同时，分选压力也需调低，低于成年造血细胞所需的条件。 例如，在FACSAria上进行分选时，喷嘴直径为100微米，分选压力为30 psi。
8. 在干细胞分析中，通过FACS从卵黄囊中分离并分选出表达cKit、CD34和CD41三种标志物的三重阳性细胞，从AGM中分离出cKit和CD34双阳性细胞。 典型的流式图如下所示：对cKit阳性细胞同时或分别分析其CD34和CD41的表达情况。 通常，每种标志物的阳性程度呈现梯度分布，而干细胞群体则位于阳性细胞的一个亚群中。 这些结果表明，我们获得了良好的细胞得率，每个卵黄囊和每个AGM可获得100–300个细胞。