通过在上丘表面施加氟金逆行标记视网膜神经节细胞

摘要

本视频介绍了通过将荧光金（fluoro-gold, FG）施加于上丘（superior colliculus, SC）表面，逆行标记视网膜神经节细胞（RGC）的方法。该技术包括钻开颅骨、吸除皮层，并在整个SC背侧表面覆盖明胶海绵。

摘要

视网膜神经节细胞（RGC）计数对于评估视网膜变性（尤其是青光眼）至关重要。可靠的RGC标记是评价任何治疗效果的基础。已知在大鼠中约98%的RGC投射至对侧上丘（SC）（Forrester and Peters, 1967）。将氟金（fluoro-gold, FG）应用于SC表面可标记几乎全部RGC，从而可针对青光眼中最易受损的视网膜神经元进行研究。FG被视网膜神经节细胞的轴突末梢摄取，并通过逆行运输双侧转移至其在视网膜中的胞体。与将FG置于横断视神经残端2天以逆行标记RGC的方法相比，该方法对RGC存活的干扰最小。与能够染色RGC、无长突细胞以及视网膜神经节细胞层中血管内皮细胞的焦油紫（cresyl violet）染色相比，该标记方法对RGC更具特异性。本视频介绍了通过将FG应用于SC表面实现RGC逆行标记的方法。手术步骤包括颅骨钻孔、吸除皮层以暴露SC，以及将明胶海绵覆盖于SC整个背侧表面。视频还提供了避免严重颅内出血和误吸SC的实用技巧。 关键词：视网膜神经节细胞，RGC计数，逆行标记，氟金，上丘，青光眼，大鼠，视网膜变性，明胶海绵，颅骨钻孔

方案

1. 通过腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）（体积比为2:1）对大鼠进行麻醉。手术期间涂抹无菌眼用润滑软膏，以防止角膜干燥。
2. 剃除头部毛发（从眼睛至耳部水平），使用头夹将头部固定于头架上，并将门齿固定于门齿杆中。
3. 用10%聚维酮碘溶液对术区进行消毒，随后使用70%酒精脱碘。
4. 切开皮肤和肌肉组织，暴露颅骨及颅缝（矢状缝、冠状缝和横缝）（图1）。在切口区域滴加局部镇痛药布比卡因作为浸润处理（剂量不超过2 mg/kg）。
5. 在矢状缝两侧各钻一个颅骨孔（直径2×2 mm，距离矢状缝和横缝均为0.5 mm）。操作时避免损伤脑膜及位于颅缝下方的静脉窦。
   
   
   图1. 活体大鼠颅骨标志。
   
   
6. 使用弹簧剪小心剪开脑膜，避免撕裂。
7. 使用真空泵小心吸除覆盖在上丘背侧表面的脑组织，在此过程中可观察到三个关键点：
   1. 脑组织颜色由灰色变为白色，再变回灰色
   2. 当无色脑脊液流出时，停止吸引
   3. 小心地在水平方向上逐步扩大最低吸力范围，以暴露被硬脑膜覆盖的淡黄色上丘
8. 继续吸除上丘上方的脑组织，直至在显微镜下可直接观察到上丘的四个边缘。切除的脑皮层范围应尽可能小，以避免产生不良副作用（如运动功能障碍）。操作时注意不要触碰静脉窦。
9. 使用无菌细棉条吸干骨孔内的液体，使上丘表面尽可能干燥。然后将预先用6% Fluoro-Gold浸泡过的明胶海绵薄层覆盖于上丘表面（Fluoro-Gold可被视网膜神经节细胞的轴突末梢摄取，并通过逆行运输双侧传递至其在视网膜中的胞体）。
10. 用明胶海绵填塞骨孔，并使用缝合夹闭合皮肤切口。
11. 将动物置于白炽灯下恢复体温并保持温暖。在上丘标记后5天内，通过饮水口服给予镇痛药布伦诺啡（100 mcg/kg）。

讨论

1. 为何使用这种手术方法进行视网膜神经节细胞计数？
   
   在大鼠中，约98%的视网膜神经节细胞（RGC）已知投射至对侧上丘（SC）。将氟金（fluoro-gold）施加于SC表面，几乎可标记所有RGC，从而使我们能够专注于青光眼中最易受损的视网膜神经元。与将氟金置于横断视神经残端进行为期两天的逆行标记相比，该方法对RGC存活的干扰最小。与焦油紫（cresyl violet）染色相比，后者会染色视网膜神经节细胞层中的无长突细胞、RGC以及血管内皮细胞，而本方法对RGC具有更高的特异性。
   
   
2. 如何避免过度出血？
   
   首先，通过检查肌肉张力和角膜反射，确保大鼠已充分麻醉。麻醉不足将导致大量出血。其次，避免可能损伤静脉窦的操作，例如钻孔位置过于靠近缝合线，或撕裂脑膜进入静脉窦壁。第三，需特别注意保持覆盖于SC表面的硬脑膜完整，尤其是在鼻侧区域。
   
   
3. RGC被标记需要多长时间？
   
   在SC标记后四天，RGC即可被标记。我通常等待七天以获得更佳的标记效果。