体外标记人胚胎干细胞用于磁共振成像

摘要

在本视频中，我们展示了如何使用氯化锰（MnCl₂）标记人类胚胎干细胞（hESC），当细胞处于生物活性状态时，氯化锰可通过电压门控钙通道进入细胞。此外，我们还展示了将MnCl₂作为细胞磁共振成像（MRI）对比剂，用于评估hESC的体外存活能力。

摘要

人类胚胎干细胞（hESC）已显示出修复受损心肌的能力。磁共振成像（MRI）已成为评估受损心肌修复情况的主要成像手段之一。此外，体外标记剂（如氧化铁纳米颗粒）已被用于追踪和定位移植的干细胞。然而，该方法无法监测移植细胞存活能力这一基本的细胞生物学特性。已知当细胞处于生物活性状态时，氯化锰（MnCl₂）可通过电压门控钙离子（Ca²⁺）通道进入细胞，并在细胞内积聚，产生T¹缩短效应。因此，我们提出，锰增强MRI可用于监测hESC移植至心肌后细胞的存活情况。

在本视频中，我们将展示如何用 MnCl₂ 对人胚胎干细胞（hESC）进行标记，以及如何通过体外 MRI 清晰地观察这些细胞。同时，将利用 Ca²⁺ 通道激动剂和拮抗剂调节 Ca²⁺ 通道的生物学活性，以评估伴随的信号变化。

方案

人胚胎干细胞的锰标记

1. 将已在无饲养层条件下培养的人胚胎干细胞进行胰蛋白酶消化5分钟。加入培养基中和胰蛋白酶。
2. 在20°C下以800 rpm离心5分钟使细胞沉淀。重新悬浮细胞沉淀后，通过台盼蓝染色计数细胞数量。根据所获得的细胞计数结果，将细胞均分为四份，每份300万个细胞，分装至锥形管中。再次通过离心使细胞沉淀。
3. 在即将开始锰标记前，用0.9%氯化钠溶液溶解新鲜的氯化锰，配制0.1 mM的氯化锰溶液。
4. 为观察钙通道活性，准备了四个样品。第一个样品为对照组，仅含在0.9%氯化钠溶液中孵育的细胞；第二个样品含在0.1 mM MnCl₂中孵育的细胞；第三和第四个样品则分别含在0.1 mM MnCl₂中孵育的细胞，并额外加入5 μM的Ca²⁺通道激动剂(s)-(-)-Bay K8644或250 μM的Ca²⁺通道拮抗剂维拉帕米。将四个样品在37°C、5% CO₂条件下孵育30分钟。
5. 30分钟后，在20°C下以800 rpm离心5分钟使细胞沉淀，吸除上清液，并用PBS洗涤标记后的细胞两次。洗涤后，将每份细胞沉淀重新悬浮于200 μL PBS中，转移至PCR管中。这些细胞沉淀通常呈白色。

人胚胎干细胞的铁标记

1. 将临床级硫酸鱼精蛋白与蒸馏水混合，配制成 1 mg/mL 的储存液。
2. 在含有人胚胎干细胞培养基的离心管中，加入终浓度为 100 μg/mL 的超顺磁性氧化铁颗粒（ferumoxides），随后加入 12 μg/mL 的硫酸鱼精蛋白。剧烈混匀溶液 5 分钟。
3. 将上述混合溶液加入等体积的细胞培养基中，使终浓度为 50 μg/mL 的ferumoxides和 6 μg/mL 的硫酸鱼精蛋白，用于细胞标记。将细胞在此溶液中孵育 12 小时。
4. 用 PBS 洗涤细胞两次，最后一次洗涤液中加入 10 U/mL 肝素，以溶解细胞外的ferumoxides-硫酸鱼精蛋白复合物。洗涤后，用胰蛋白酶消化细胞，获得单细胞悬液。
5. 计数细胞，并分装为所需数量的样品。洗涤后，将每份细胞沉淀重悬于 200 μL PBS 中，转移至 PCR 管。这些细胞沉淀应呈深橙褐色。

进行细胞磁共振成像

1. 制备一个模体，用于固定含有细胞沉淀的试管，并在扫描过程中避免周围空气造成的伪影。具体方法为：将0.8%的琼脂和1%的硫酸铜溶于蒸馏水中，通过微波加热5–7分钟至沸腾。将该混合物冷却至少1小时，使其形成凝胶后用于扫描。
2. 将含有标记细胞沉淀的试管放入模体中进行扫描。体外细胞磁共振成像在Signa HDx 3T MRI（GE Medical Systems）仪器上使用临床膝关节线圈完成。
3. 对三个样本中的锰标记细胞采用自旋回波序列进行扫描：TR（重复时间）= 800毫秒；TE（回波时间）= 最小值；FOV（视野）= 12 × 12 cm；矩阵 = 256×256；NEX = 1。
4. 对铁标记细胞采用梯度回波序列进行扫描。成像参数如下：TR = 100毫秒；TE = 10毫秒；FA（翻转角）= 30°；FOV = 12 × 12 cm；矩阵 = 256 × 256；NEX = 1。

分析 MRI 结果

1. 分析4个不同样本的锰标记细胞MRI扫描图像：
   • 样本#1为对照组，含有仅在0.9%氯化钠溶液中孵育的细胞。
   • 样品 #2 含有在 0.1 mM MnCl 中孵育的细胞₂.
   • 样品 #3 包含在 0.1 mM MnCl 中孵育的细胞₂ 使用5 μM的Ca²⁺-通道激动剂，(S)-(-)-Bay K8644
   • 样品 #4 包含在 0.1 mM MnCl 中孵育的细胞₂ 使用 250 μM 的 Ca²⁺-通道拮抗剂，维拉帕米。
2. 正如所预测的，锰标记细胞的信号强度差异可见。与仅用锰标记的细胞相比，在钙通道激动剂存在时信号强度明显增强，而在钙通道拮抗剂存在时信号强度降低。使用Image J软件（NIH, Bethesda, MD, USA）测量锰标记细胞信号强度增加的区域。同一软件也用于分析铁标记细胞产生的暗区离共振信号的面积。铁标记细胞产生的暗信号区域大小取决于细胞数量或细胞内含铁颗粒的数量。在此情况下，一百万个细胞所产生的暗信号区域小于来自 三百万个细胞

讨论

这些结果表明，锰可通过电压门控钙通道进入细胞，且锰可用作磁共振成像（MRI）对比剂，同时反映细胞活力。因此，我们建议，锰增强磁共振成像可用于监测人胚胎干细胞移植至心肌后细胞的存活情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四水合氯化锰	试剂	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	试剂	Sigma-Aldrich	B133
(+)-盐酸维拉帕米，滴定纯度不低于99.0%	试剂	Sigma-Aldrich	V4629
氯化钠 0.85-0.90% W/V	试剂	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	试剂	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	含铁11.2mg/mL的葡聚糖铁注射液
硫酸鱼精蛋白	试剂	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR（胚胎干细胞用血清替代物）	试剂	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	试剂	GIBCO, by Life Technologies	11330
2-巯基–乙醇 98+%	试剂	Sigma-Aldrich	M 3148
L-谷氨酰胺 200 mM 100倍浓缩液	试剂	GIBCO, by Life Technologies	25030
青霉素-链霉素 10,000 单位/mL	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM 非必需氨基酸 100倍浓缩液	试剂	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	工具	GE Healthcare
临床膝关节线圈	工具	GE Healthcare
DPBS	试剂	GIBCO, by Life Technologies	14190