利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

摘要

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖腺以创建转基因动物的技术。

摘要

通过将DNA质粒溶液显微注射到秀丽隐杆线虫的性腺中，可轻松构建转基因秀丽隐杆线虫 ¹质粒DNA会重排形成游离于染色体外的串联多联体，可稳定遗传，但其遗传效率不及真正的染色体 ²将目的基因与一个具有明显表型标记的基因（如 rol-6 或 GFP）共同注射，以便在解剖显微镜下筛选转基因动物。外源基因可由其天然启动子驱动，用于细胞定位研究；或者，也可由另一种组织特异性启动子驱动，以评估该基因产物在特定细胞或组织中的功能。该技术可高效地在秀丽隐杆线虫（C. elegans）除生殖系或早期胚胎以外的所有组织中驱动基因表达。 ³转基因动物的创建被广泛应用于多种实验研究范式中。本视频展示了通过显微注射技术制备转基因线虫的方法。此外，还介绍了稳定转基因秀丽隐杆线虫品系的筛选与维持方法。

方案

表达质粒构建

需要两种质粒：一种用于目的基因的组织特异性表达，另一种作为可选择的转化标记。

实验质粒

1. 选择在目标组织/细胞类型中表达的启动子，例如神经或肌肉特异性启动子。若需在同一组织中表达多个基因，可使用 Gateway 系统（Invitrogen）中的启动子盒质粒。该方法可通过重组克隆将任何目的基因插入启动子的下游⁴。通常，上游序列长度为 2–5 kb 即可实现正确且精确的表达。
   
   
2. 目的基因的 cDNA 可通过两种方法进行克隆：
   1. 使用限制性内切酶进行传统克隆。
   2. 对于 Gateway 克隆，需使用含有 Gateway att B 重组序列的引物通过 PCR 扩增获得 cDNA。将扩增后的 cDNA 首先与供体载体 pDONR201 进行重组以构建入门载体，然后转化至 E. coli DH5α 菌株中。在筛选出成功的重组子并进行质粒小量提取后，将入门载体与含有启动子的目的载体进行重组，从而构建表达质粒。有关重组克隆的详细信息可参见 Invitrogen Gateway 手册或 Caldwell 等人⁵的研究。

可筛选标记质粒

讨论

进行此操作时，需注意以下几点：
- 直接将液体注射至性腺中心
- 注射液体量不宜过多
- 操作应迅速，以防止干燥。

如果针头出现问题，例如断裂或开口过大，最好重新制作新的针头，而不应使用不理想的针头进行注射。

转基因线虫的制备具有多种应用，例如：
- 通过称为转化拯救的方法鉴定突变基因
- 通过表达截短蛋白来定位蛋白结构域
- 鉴定基因在细胞及疾病过程中的作用。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	超纯级	Invitrogen	15510-027
卤碳油，Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
盖玻片 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
盖玻片 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
盖玻片 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 µl 毛细管		VWR international	53432-921
针用玻璃毛细管	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
拉针仪	工具	Narishige International	Model PP-830
微量注射系统		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	显微镜、载物台、操纵器
带荧光功能的体视显微镜	显微镜	Nikon Instruments	SMZ800
体视显微镜	显微镜	Nikon Instruments	SMZ645