本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖腺以创建转基因动物的技术。
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本文内容
摘要
摘要
通过将DNA质粒溶液显微注射到秀丽隐杆线虫的性腺中，可轻松构建转基因秀丽隐杆线虫 1质粒DNA会重排形成游离于染色体外的串联多联体，可稳定遗传，但其遗传效率不及真正的染色体 2将目的基因与一个具有明显表型标记的基因（如 rol-6 或 GFP）共同注射，以便在解剖显微镜下筛选转基因动物。外源基因可由其天然启动子驱动，用于细胞定位研究；或者，也可由另一种组织特异性启动子驱动，以评估该基因产物在特定细胞或组织中的功能。该技术可高效地在秀丽隐杆线虫（C. elegans）除生殖系或早期胚胎以外的所有组织中驱动基因表达。 3转基因动物的创建被广泛应用于多种实验研究范式中。本视频展示了通过显微注射技术制备转基因线虫的方法。此外，还介绍了稳定转基因秀丽隐杆线虫品系的筛选与维持方法。
方案
表达质粒构建
需要两种质粒：一种用于目的基因的组织特异性表达，另一种作为可选择的转化标记。
实验质粒
- 选择在目标组织/细胞类型中表达的启动子，例如神经或肌肉特异性启动子。若需在同一组织中表达多个基因，可使用 Gateway 系统（Invitrogen）中的启动子盒质粒。该方法可通过重组克隆将任何目的基因插入启动子的下游4。通常，上游序列长度为 2–5 kb 即可实现正确且精确的表达。
- 目的基因的 cDNA 可通过两种方法进行克隆：
- 使用限制性内切酶进行传统克隆。
- 对于 Gateway 克隆，需使用含有 Gateway att B 重组序列的引物通过 PCR 扩增获得 cDNA。将扩增后的 cDNA 首先与供体载体 pDONR201 进行重组以构建入门载体，然后转化至 E. coli DH5α 菌株中。在筛选出成功的重组子并进行质粒小量提取后，将入门载体与含有启动子的目的载体进行重组，从而构建表达质粒。有关重组克隆的详细信息可参见 Invitrogen Gateway 手册或 Caldwell 等人5的研究。
可筛选标记质粒
转基因标记质粒的示例包括 rol-6，或使用体壁肌肌动蛋白启动子 unc-54 驱动荧光蛋白的表达。这些标记质粒通常可根据要求从科研社区获得。
秀丽隐杆线虫的显微注射
准备
- 对将要注射的两种质粒进行DNA提取。定量后，将它们以每种50 ng/µl的浓度按1:1比例混合。
- 制备琼脂垫：
- 用去离子水配制2%的琼脂糖溶液，加热或微波至完全溶解。
- 在实验台上放置若干片22 × 50 mm的盖玻片。
- 使用巴斯德吸管，将一滴熔化的琼脂糖溶液滴在一片盖玻片上，立即以90度角将另一片盖玻片覆盖在液滴上。对其他几片盖玻片重复此操作。压平后的琼脂糖圆盘直径应在15–20 mm之间。
- 待琼脂糖凝固（仅需数秒）后，移去上层盖玻片，并让琼脂垫在空气中彻底干燥（数小时至过夜）。
- 将制备好的琼脂垫存放于盖玻片盒中，室温保存。
- 制备用于DNA溶液的进样毛细管：
进样毛细管由100 µl的毛细管制成，将其在明火上中间部位加热后迅速拉伸至原长度的约两倍。待毛细管冷却后，将其折断为两段。为注射准备10–20根进样毛细管，并直立存放于微量离心管架中。操作时需小心，避免被尖端刺伤。 - 制备显微注射针：
显微注射针由含有内部玻璃丝的特殊毛细管拉制而成；该玻璃丝可作为DNA溶液的导流芯。使用针头拉制仪进行拉制。我们使用Narishige PP-830拉针仪，加热参数设置为24.8。可同时拉制多个针头，并存放于小型塑料盒中。多个针头可方便地“固定”在一条模型黏土条上，用于长期保存。 - 针尖“破口器”：
显微注射针的针尖被拉得极细，末端实际是封闭的，需使用小片盖玻片将其轻触破开。破口器的制备方法为：将一块18 × 18 mm的盖玻片用纸巾包裹，轻轻施加压力使其碎裂成若干片。大小约为3 × 4 mm的碎片较为适用。 - 按照标准操作方法6将野生型（N2）线虫培养至早期成虫阶段用于注射。每种构建体注射时准备约100条发育阶段合适的线虫。
实验步骤
- 打开连接至显微注射针臂和持针器的氦气瓶主阀。关闭调压阀，使气体进入管路，将压力升至35 psi。注意可通过脚踏板释放气体。
- 将针式加样器插入标准口径移液管软管（见于玻璃毛细管容器中），吸取少量质粒混合物（约 1 µl）。
- 将针头装载器小心插入注射针的后端，轻柔地沿针管全长推进，直至遇到阻力。轻轻吹出DNA溶液，然后取出装载器。
- 将针头插入显微注射臂，注意将其置于内部的小型橡胶垫圈内。
- 在琼脂垫的一侧边缘放置一片用于折断针头的盖玻片碎片。用卤代烃油覆盖该碎片以及琼脂垫的整个表面。将琼脂垫置于倒置显微镜的载物台上。
- 使用4倍物镜和明场照明，将针头置于视野中央，但暂不将其浸入油中。同时，将盖玻片碎片的内边缘置于视野中心，并对其进行聚焦（仍使用4倍物镜）。将针头缓慢 lowered 浸入油中，使其与盖玻片碎片处于同一焦平面。通过切换至40倍物镜提高放大倍数，重新对盖玻片碎片边缘聚焦，并在必要时调整针尖位置。
- 轻轻将注射针尖抵住盖玻片碎片的边缘，同时用脚踏板短暂地施加一次气体脉冲，以打开针尖。当针尖末端有小液滴渗出时，即表明针已充分打开。若开口过大导致液体过量流出，会杀死受试动物，应避免。
- 将针头抬起，从载物台上取下琼脂垫，但不要改变X轴或Y轴位置。将载物台从针头下方滑出，取下琼脂垫并将其放置在解剖显微镜上。将一条线虫转移至琼脂垫上，位于油层表面之下。若线虫扭动，可轻轻触碰其身体，直至其接触琼脂垫。湿润的线虫应能黏附于干燥的琼脂糖表面。
- 注射
- 迅速将琼脂垫放回载物台上，使线虫位于视野中央。
- 将针头降至与线虫相同的焦平面。
- 切换至霍夫曼照明（一种对比度滤光方式），以便观察线虫的形态细节。若倒置显微镜配备诺马尔斯基微分干涉（Nomarski/DIC）光学系统，亦可使用。使用40倍物镜，聚焦于线虫生殖腺中呈“颗粒状”的合胞体中心。 选择位于虫体朝向针头一侧的性腺（即位于生殖细胞核“蜂窝状”排列下方的性腺）。
- 微调针的位置，直至针尖也处于焦点平面（与性腺的“颗粒状”结构在同一平面）。
- 轻轻将针插入性腺中心，施加短暂的气体压力，将一至两滴 DNA 溶液注入性腺臂中。应可观察到液体波纹向远端性腺扩散。切勿认为注入液体越多越好，因为过量液体可能流入性腺臂近端弯曲处，从而抑制卵细胞的产生。若条件允许，根据线虫的位置，以相同方式注射另一侧性腺臂。
- 注射线虫时需迅速操作，因其容易脱水。是否注射第二条生殖腺臂取决于重新定位针头和线虫的速度。整个过程理想情况下应耗时不超过1-2分钟。
- 从载物台上取下盖玻片并置于解剖显微镜下。加入1µl M9缓冲液（22mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，85 mM NaCl，1 mM MgSO₄4将缓冲液直接滴加到已注射的线虫上（可能需要将移液器尖端浸入卤代烃油表面以下）。缓冲液会重新水合线虫，使其从琼脂糖垫表面漂浮起来。使用线虫挑取工具将线虫转移至普通培养皿中。琼脂糖垫可重复使用多次，直至被缓冲液过度饱和而无法再使线虫附着为止。
转基因筛选
- 将注射后的线虫（P0 代）转移到单独的新鲜细菌接种培养板（60 mm）上，使其繁殖。通常将注射后的个体在 20°C 下培养 2–3 天，直至后代出现。
- 使用荧光体视显微镜观察 F1 代后代是否表现出转基因标记（如荧光）。将每只带有荧光信号的 F1 代携带者单独克隆至新的培养板上（因为每个 F1 个体的后代被视为一个独立的品系）。让 F1 代雌雄同体个体继续繁殖。此步骤通常也在 20°C 下进行 2–3 天，直至后代出现。
- 同样观察 F2 代中是否存在转基因个体。那些继承并表达转基因阵列的 F2 个体被视为“稳定”品系。
注意：在 F1 代阶段可能会出现多个转基因个体，但它们并不稳定。大多数 F1 代转基因个体无法传递至 F2 代形成稳定品系。
注意：为控制基因拷贝数的变异性，每种注射的构建体应至少建立三个独立的稳定品系。 - 每个独立的稳定品系应作为独立的线虫品系进行维持。通过在每一代将若干转基因个体转移至新培养板的方式进行扩繁；若筛选标记为荧光，则此操作必须在荧光体视显微镜下完成。
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讨论
进行此操作时，需注意以下几点：
- 直接将液体注射至性腺中心
- 注射液体量不宜过多
- 操作应迅速，以防止干燥。
如果针头出现问题，例如断裂或开口过大，最好重新制作新的针头，而不应使用不理想的针头进行注射。
转基因线虫的制备具有多种应用，例如：
- 通过称为转化拯救的方法鉴定突变基因
- 通过表达截短蛋白来定位蛋白结构域
- 鉴定基因在细胞及疾病过程中的作用。
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致谢
我们谨向Caldwell实验室所有成员的合作精神表示感谢。本实验室的运动障碍研究得到了Bachmann-Strauss肌张力障碍与帕金森基金会、美国帕金森基金会、美国帕金森病协会、阿拉巴马州帕金森病协会、迈克尔·J·福克斯帕金森病研究基金会以及本科生研究项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | 超纯级 | Invitrogen | 15510-027 | |
| 卤碳油，Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| 盖玻片 18x18 mm | Fisher Scientific | 12-548-A | ||
| 盖玻片 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| 盖玻片 22x50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | ||
| 100 µl 毛细管 | VWR international | 53432-921 | ||
| 针用玻璃毛细管 | "Kwik-Fil" | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| 拉针仪 | 工具 | Narishige International | Model PP-830 | |
| 微量注射系统 | Tritech Research, Inc. | MINJ-1000 | 显微镜、载物台、操纵器 | |
| 带荧光功能的体视显微镜 | 显微镜 | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| 体视显微镜 | 显微镜 | Nikon Instruments | SMZ645 |
参考文献
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
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重印与许可
