秀丽斑马鱼多巴胺能神经元变性检测法在帕金森病潜在致病基因验证中的应用

摘要

本视频展示了如何利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为帕金森病的模型，评估多巴胺能神经元的神经退行性变。此外，还通过遗传筛选来鉴定能够增强退行性变或具有神经保护作用的因子。

摘要

帕金森病（PD）的诊断与治疗进展依赖于对易感因素的了解，这些因素使特定人群面临患病风险。在尝试鉴定与PD相关的新遗传因素过程中，科学家已列出大量候选基因、多态性位点及蛋白质，这些发现代表了重要进展，但其作用机制仍不明确。我们的研究旨在利用简单的动物模型系统优势，显著缩小这些候选名单。人类拥有数十亿个神经元，而显微镜下的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）仅有302个神经元，其中在雌雄同体个体中仅有八个神经元产生多巴胺（DA）。在C. elegans的多巴胺能神经元中表达编码PD相关蛋白α-突触核蛋白（alpha-synuclein）的人源基因，会导致剂量和年龄依赖性的神经退行性病变。

在多巴胺能神经元中表达人源α-突触核蛋白的线虫为同基因型，其绿色荧光蛋白（GFP）和人源α-突触核蛋白均在多巴胺转运体启动子（Pdat-1）驱动下表达。GFP的存在可作为易于观察的标记物，用于追踪这些动物中多巴胺能神经元的退行性变。我们最初证实，在这些线虫中，具有分子伴侣活性的蛋白torsinA能够挽救α-突触核蛋白诱导的多巴胺能神经元退行性变¹。此外，我们实验室通过大规模RNAi筛选，利用α-突触核蛋白错误折叠检测方法鉴定出一系列与帕金森病（PD）相关的候选基因，并将其在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的多巴胺能神经元中过表达。我们发现，在测试的七个基因中，有五个基因能显著挽救α-突触核蛋白诱导的多巴胺能神经元退行性变，表明其为重要的PD候选调控因子²。此外，Lindquist实验室（本期JoVE）开展了酵母筛选实验，以α-突触核蛋白依赖性毒性作为读出指标，筛选可增强或抑制细胞毒性的基因。随后，我们在线虫α-突触核蛋白诱导的神经退行性变检测模型中检验了这些酵母筛选获得的候选基因，并成功验证了其中多个靶点^{3, 4}。

本研究方法包括利用重组克隆技术，在Pdat-1启动子调控下将候选基因的cDNA插入，构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）多巴胺能神经元（DA神经元）特异性表达载体。随后将这些质粒与用于筛选成功转化的标记基因共同显微注射到野生型（N2）线虫中。获得多个在DA神经元中稳定表达候选蛋白的转基因品系，再分别与α-突触核蛋白变性品系杂交，并在衰老过程中从个体动物和单个神经元水平评估神经退行性病变情况。

方案

A. 表达质粒构建

需要两种质粒：一种用于在特定组织中表达目的基因，另一种作为可选择的转化标记（尽管标记质粒通常可从科研社区获得）。

实验质粒

1. 选择在目标组织/细胞类型中表达的启动子；在此情况下，使用多巴胺转运蛋白（Pdat-1）启动子。该表达质粒被构建成适用于Invitrogen Gateway系统的载体（pDEST-DAT-1），以便通过重组克隆方法将任何目的基因插入启动子下游¹。
2. 使用含有Gateway att B重组序列的引物，通过PCR扩增目的基因的cDNA。将扩增得到的cDNA首先与供体质粒pDONR201进行重组，构建入门质粒，然后转化至大肠杆菌DH5α菌株中。在筛选出成功的重组子并进行质粒小提后，将入门质粒与pDEST-DAT-1目的载体进行重组，从而构建表达质粒。有关重组克隆的详细信息可参见Invitrogen Gateway手册或Caldwell等人的文献⁵。

可筛选标记质粒

转基因标记质粒由一个载体构成，该载体包含一个启动子，可驱动荧光蛋白在特定组织中表达。在此特定实验中，unc-54 启动子驱动樱桃蛋白在体壁肌中表达（Punc-54::cherry）。

B. 通过显微注射法构建转基因秀丽隐杆线虫

参见相关 JoVE 文章： https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. 用于DA神经退行性分析的遗传杂交

1. 采用标准方法培养线虫⁶。
2. 将10条Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP雄性线虫^{1, 2}放置于交配平板上，与3-4条处于L4期的转基因雌雄同体线虫（表达Pdat-1::gene X和Punc-54::cherry）进行交配。该操作需针对所构建的三个独立稳定品系分别进行。两天后，移除雄性线虫。
3. 检查F1代；若出现多个雄性后代，则表明交配成功。
4. 从每次杂交后代中挑选5条同时表现出Pdat-1::GFP荧光标记（来自父本）和Punc-54::cherry荧光体壁肌标记（来自母本）的L4期雌雄同体线虫进行克隆培养。所挑选的线虫必须处于L4期，以确保其尚未与平板上的雄性个体交配。让其自交繁殖，产生F2代后代。
5. 将第3步中获得的F2代个体进行克隆培养。具体而言，将约5-10条同时表达两种荧光标记的个体分别转移至独立的培养平板。在F3代中筛选那些所有个体均在DA神经元中表达GFP，且部分个体在体壁肌细胞中表达cherry荧光的平板。这些个体将对Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP基因座为纯合状态，并能稳定遗传新构建的转基因（gene X）。

D. 多巴胺能神经元分析

1. 为上述构建的三个品系以及单独的 Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP 品系分别准备新鲜培养板，让其生长至成虫期。
2. 将每个品系的 30–40 只转基因成虫转移至新鲜培养板上，在 20ºC 条件下让其产卵 4 小时。
3. 移除成虫，将胚胎在 20ºC 下继续培养 3–4 天，直至发育至 L4 幼虫阶段。
4. 挑取约 100 只转基因 L4 期线虫至含有 0.04 mg/ml 5-氟-2'-脱氧尿苷（FUDR）的培养板中。该核苷类似物通过抑制 DNA 合成阻断下一代的发育，从而防止子代过度繁殖而影响实验动物 ⁷。FUDR 培养板需避光保存，因其对光敏感。
5. 在产卵后的不同时间点对成虫进行分析。具体的分析时间点需通过实验经验确定。例如，我们已确定 Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP 动物在发育后第 6、7 和 10 天时，分别有 77%、87% 和 90% 个体表现出多巴胺能（DA）神经元退化。因此，若预测目标转基因可能加剧神经退行性变，则选择在第 6 天和/或第 7 天进行分析；反之，若转基因可能抑制神经退行性变，则选择在第 7 天和第 10 天进行分析。
6. 制备 4 个新鲜的琼脂糖垫（与用于显微注射的琼脂糖垫不同，这些垫需新鲜使用，不能干燥）。准备两张载玻片，每张上横向贴一条胶带；胶带作为间隔物，确保琼脂糖垫厚度一致。将第三张载玻片并排置于工作台面上（三张载玻片并列放置）。在中间的载玻片中央滴加一滴熔化的琼脂糖，迅速将另一张载玻片垂直压在琼脂糖上，并横跨三张载玻片。重复此操作制备多个琼脂糖垫，两片载玻片保持叠压状态，直至垫片准备使用。
7. 为分析线虫的多巴胺能神经元，在 22 × 30 mm 的盖玻片上滴加 6 μl 3 mM 左旋咪唑（一种麻醉剂）。挑取 40 只成虫（比需评分的 30 只多出 10 只）放入液滴中，然后将盖玻片倒置覆盖在琼脂糖垫上。对其他各品系重复此操作。
8. 使用配备落射荧光装置及 FITC 或 GFP 滤光片组的复式显微镜，对每个品系的 30 只动物分别评分其 CEP 和 ADE 神经元的存在情况。我们使用 Endow GFP HYQ 滤光片组（Chroma Technology）。将数据记录在附带的评分表上。野生型动物在全部 4 个 CEP 和 2 个 ADE 神经元中均保持完整的 GFP 荧光。个体动物若出现多巴胺能神经元缺失，则记为非野生型或“退化”表型。此外，还可通过统计每只动物丢失的神经元总数以及群体中的总体丢失情况，进一步量化退化程度。
9. 重复该分析两次（每次每品系再分析 30 只动物）。三次分析中每品系表现出野生型多巴胺能神经元的线虫总数取平均值。随后采用学生 t 检验（p < 0.05）进行统计学分析，比较对照组线虫（Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP）与在多巴胺能神经元中过表达候选基因的品系之间的神经保护效应。

讨论

多巴胺能神经元随年龄增长而丢失是帕金森病的临床特征，与一种名为α-突触核蛋白的蛋白质的积聚或错误折叠有关。本文演示如何通过荧光转基因标记秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的多巴胺能神经元，并通过在这些细胞中共表达人源α-突触核蛋白，模拟帕金森病中出现的神经退行性变。

本视频展示了转基因线虫的培养、遗传杂交、制片及观察评分方法，用于评估在衰老过程中增强神经退行性变或提供神经保护作用的遗传因素。实验中需注意使用适当的标记物，并选择合适发育阶段的雄性与雌雄同体个体，以确保遗传杂交的成功，以及在评分神经元丢失或保护情况时保持一致性。通过该方法，C. elegans 可用于快速评估可能促进神经退行性变或作为增强神经元存活治疗靶点的遗传因子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	超纯级	Invitrogen	15510-027
盖玻片 20x30 mm		费舍尔科学公司	12-548-5A
载玻片	普通，3x1"	费舍尔科学公司	12-549
带荧光的体视显微镜	显微镜	尼康仪器公司	SMZ800
体视显微镜	显微镜	尼康仪器公司	SMZ645
落射荧光显微镜	显微镜	尼康仪器公司	Model E-800
滤光片立方体，GFP HYQ	Endow 带通	Chroma Technology Corp.