本视频展示了如何利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为帕金森病的模型，评估多巴胺能神经元的神经退行性变。此外，还通过遗传筛选来鉴定能够增强退行性变或具有神经保护作用的因子。
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摘要
摘要
帕金森病（PD）的诊断与治疗进展依赖于对易感因素的了解，这些因素使特定人群面临患病风险。在尝试鉴定与PD相关的新遗传因素过程中，科学家已列出大量候选基因、多态性位点及蛋白质，这些发现代表了重要进展，但其作用机制仍不明确。我们的研究旨在利用简单的动物模型系统优势，显著缩小这些候选名单。人类拥有数十亿个神经元，而显微镜下的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）仅有302个神经元，其中在雌雄同体个体中仅有八个神经元产生多巴胺（DA）。在C. elegans的多巴胺能神经元中表达编码PD相关蛋白α-突触核蛋白（alpha-synuclein）的人源基因，会导致剂量和年龄依赖性的神经退行性病变。
在多巴胺能神经元中表达人源α-突触核蛋白的线虫为同基因型，其绿色荧光蛋白（GFP）和人源α-突触核蛋白均在多巴胺转运体启动子（Pdat-1）驱动下表达。GFP的存在可作为易于观察的标记物，用于追踪这些动物中多巴胺能神经元的退行性变。我们最初证实，在这些线虫中，具有分子伴侣活性的蛋白torsinA能够挽救α-突触核蛋白诱导的多巴胺能神经元退行性变1。此外，我们实验室通过大规模RNAi筛选，利用α-突触核蛋白错误折叠检测方法鉴定出一系列与帕金森病（PD）相关的候选基因，并将其在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的多巴胺能神经元中过表达。我们发现，在测试的七个基因中，有五个基因能显著挽救α-突触核蛋白诱导的多巴胺能神经元退行性变，表明其为重要的PD候选调控因子2。此外，Lindquist实验室（本期JoVE）开展了酵母筛选实验，以α-突触核蛋白依赖性毒性作为读出指标，筛选可增强或抑制细胞毒性的基因。随后，我们在线虫α-突触核蛋白诱导的神经退行性变检测模型中检验了这些酵母筛选获得的候选基因，并成功验证了其中多个靶点3, 4。
本研究方法包括利用重组克隆技术，在Pdat-1启动子调控下将候选基因的cDNA插入，构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）多巴胺能神经元（DA神经元）特异性表达载体。随后将这些质粒与用于筛选成功转化的标记基因共同显微注射到野生型（N2）线虫中。获得多个在DA神经元中稳定表达候选蛋白的转基因品系，再分别与α-突触核蛋白变性品系杂交，并在衰老过程中从个体动物和单个神经元水平评估神经退行性病变情况。
方案
A. 表达质粒构建
需要两种质粒：一种用于在特定组织中表达目的基因，另一种作为可选择的转化标记（尽管标记质粒通常可从科研社区获得）。
实验质粒
- 选择在目标组织/细胞类型中表达的启动子；在此情况下，使用多巴胺转运蛋白（Pdat-1）启动子。该表达质粒被构建成适用于Invitrogen Gateway系统的载体（pDEST-DAT-1），以便通过重组克隆方法将任何目的基因插入启动子下游1。
- 使用含有Gateway att B重组序列的引物，通过PCR扩增目的基因的cDNA。将扩增得到的cDNA首先与供体质粒pDONR201进行重组，构建入门质粒，然后转化至大肠杆菌DH5α菌株中。在筛选出成功的重组子并进行质粒小提后，将入门质粒与pDEST-DAT-1目的载体进行重组，从而构建表达质粒。有关重组克隆的详细信息可参见Invitrogen Gateway手册或Caldwell等人的文献5。
可筛选标记质粒
转基因标记质粒由一个载体构成，该载体包含一个启动子，可驱动荧光蛋白在特定组织中表达。在此特定实验中，unc-54 启动子驱动樱桃蛋白在体壁肌中表达（Punc-54::cherry）。
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讨论
多巴胺能神经元随年龄增长而丢失是帕金森病的临床特征，与一种名为α-突触核蛋白的蛋白质的积聚或错误折叠有关。本文演示如何通过荧光转基因标记秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的多巴胺能神经元，并通过在这些细胞中共表达人源α-突触核蛋白，模拟帕金森病中出现的神经退行性变。
本视频展示了转基因线虫的培养、遗传杂交、制片及观察评分方法，用于评估在衰老过程中增强神经退行性变或提供神经保护作用的遗传因素。实验中需注意使用适当的标记物，并选择合适发育阶段的雄性与雌雄同体个体，以确保遗传杂交的成功，以及在评分神经元丢失或保护情况时保持一致性。通过该方法，C. elegans 可用于快速评估可能促进神经退行性变或作为增强神经元存活治疗靶点的遗传因子。
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致谢
我们谨向Caldwell实验室所有成员的合作精神表示感谢。实验室的运动障碍研究得到了Bachmann-Strauss肌张力障碍与帕金森基金会、美国帕金森基金会、美国帕金森病协会、阿拉巴马州帕金森病协会、迈克尔·J·福克斯帕金森研究基金会以及本科生研究项目的支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | 超纯级 | Invitrogen | 15510-027 | |
| 盖玻片 20x30 mm | 费舍尔科学公司 | 12-548-5A | ||
| 载玻片 | 普通，3x1" | 费舍尔科学公司 | 12-549 | |
| 带荧光的体视显微镜 | 显微镜 | 尼康仪器公司 | SMZ800 | |
| 体视显微镜 | 显微镜 | 尼康仪器公司 | SMZ645 | |
| 落射荧光显微镜 | 显微镜 | 尼康仪器公司 | Model E-800 | |
| 滤光片立方体，GFP HYQ | Endow 带通 | Chroma Technology Corp. |
参考文献
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A.
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