通过半变性去垢剂-琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚集

摘要

SDD-AGE 是一种用于检测和表征细胞中类淀粉样聚合物的有用技术。本文展示了一种改进方法，使该技术适用于大规模应用。

摘要

淀粉样聚集与多种蛋白质错误折叠相关病理有关，并构成了朊病毒传染性的基础。朊病毒是一类具有自我模板构象特性的蛋白质，被认为在低等生物中具有有益功能。由于淀粉样物质不溶且结构异质，其研究一直面临巨大挑战。然而，半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）技术通过基于大小和去垢剂不溶性对淀粉样聚合物进行分离，使得此类研究成为可能。该技术目前被广泛用于检测和表征淀粉样构象变异体。本文中，我们介绍了一种适用于大规模应用的SDD-AGE改进方法，例如用于筛选新型朊病毒及其他淀粉样形成蛋白。新的SDD-AGE方法采用毛细管转移技术，提高了实验的可靠性和操作便捷性，并可适配任意尺寸的凝胶。因此，可同时处理大量来自细胞或纯化蛋白的样品，以检测其中是否存在SDS不溶性的标记蛋白构象体。

方案

第1部分：制备凝胶

1. 组装凝胶制备板。可使用标准的水平DNA电泳设备。对于大量样品，我们制备一块20 cm × 24 cm的凝胶板，最多可插入四把50孔梳子。确保凝胶板表面无划痕，因为划痕可能扭曲印迹图像。
2. 在1X TAE缓冲液中配制1.5%琼脂糖溶液（中等或高凝胶强度，低电渗扩散，EEO值低）。溶液体积应足以完全浸没梳齿——为最大限度提高检测灵敏度，应尽可能多地加样。将混合液放入微波炉加热，直至琼脂糖完全溶解。
3. 迅速从10%储存液中加入SDS至终浓度0.1%，轻轻旋转混匀。若此过程中部分琼脂糖发生凝固，可在加热板上重新溶解，注意避免煮沸。
4. 将溶液倒入制备板中。用梳子轻轻拨动以去除气泡，因为气泡可能干扰后续的转膜过程。
5. 待凝胶完全凝固后，取出梳子，并将凝胶放入电泳槽中。用含有0.1% SDS的1X TAE缓冲液完全浸没凝胶。

第二部分：样品制备

1. 为了进行酵母裂解液的高通量分析，我们从在96孔板中经快速振荡过夜培养的2 ml培养物开始。本实验中，每个培养物均过表达一种目的蛋白。在分析低丰度蛋白时，必须使用更大的培养体积。
2. 以2000 RCF在室温下离心5分钟收集细胞。
3. 将细胞重悬于水中，再次离心。
4. 用1 ml 原生质体化溶液重悬。在30°C下孵育约30分钟（可通过显微镜观察确认原生质体化效率）。
5. 在室温下以800 RCF离心5分钟。彻底去除上清液。
6. 将沉淀的球状体重悬于100 ml裂解缓冲液中。
7. 用胶带封住模块，在高速下涡旋震荡2分钟。
8. 以4000 RCF离心2分钟，沉淀细胞碎片。
9. 小心地将上清液转移至新容器中，例如96孔PCR板。
10. 如有需要，测定裂解液的蛋白浓度。
11. 向样品中加入4倍浓度的上样缓冲液，配制含1倍浓度上样缓冲液的裂解液。室温孵育5分钟。
12. 上样凝胶。如需要，可保留一半样品体积，煮沸后用于SDS-PAGE分析。为便于后续监测转膜程度，应加入预染SDS-PAGE蛋白标记物。此外，可使用包含大分子量蛋白的分子量标记物（例如鸡胸肌提取物）来估算所分离蛋白复合物的大小。
13. 以低电压（≤ 3 V/cm 凝胶长度）电泳，直至染料前沿距凝胶末端约 1 cm。此过程需数小时。保持凝胶低温至关重要，否则低分子量蛋白（如单体）可能发生扩散，影响其检测。
    

第3部分：转移

1. 将一张硝酸纤维素膜裁剪成与凝胶相同尺寸。
2. 裁剪20张GB004和8张GB002转印滤纸，使其尺寸与凝胶相同。另裁剪一张GB004作为灯芯使用，其宽度应比凝胶宽约20厘米。
3. 将硝酸纤维素膜、灯芯以及4张GB002滤纸浸入1×TBS缓冲液中。
4. 在塑料容器中按以下顺序组装滤纸叠层：20张干燥的GB004，然后是4张干燥的GB002，再放一张预先润湿的GB002。将硝酸纤维素膜放置在该叠层之上。
5. 用清水短暂冲洗凝胶板以去除多余的电泳缓冲液。然后小心地将凝胶从制胶板上滑移到叠层上。在移动过程中，根据需要向膜上滴加TBS缓冲液。额外的缓冲液有助于防止气泡被困在凝胶下方。使用移液管进行此操作效果良好。
6. 将凝胶转移至叠层后，仔细检查是否存在气泡。若发现气泡，应抬起凝胶边缘并重新加入缓冲液，直至气泡被排除。
7. 将剩余的三张预先润湿的GB002滤纸覆盖在凝胶上方。用移液管在叠层表面用力滚压，确保各层之间充分接触。
8. 在转移叠层两侧各放置一个盛有TBS缓冲液的抬高容器。将预先润湿的灯芯跨过叠层放置，使其两端均浸入TBS缓冲液中。
9. 用另一个带有额外重量的塑料托盘覆盖整个组装好的转移叠层（例如，一个500 ml的水瓶）。
10. 让转移过程持续至少三小时，或过夜进行。
11. 转移完成后，膜可按标准Western印迹程序进行后续处理。

原生质球制备液
1.2 M D-山梨醇
0.5 mM MgCl₂
20 mM Tris，pH 7.5
50 mM BME（现配现加）
0.5 mg/ml Zymolyase 100T（现配现加）

裂解缓冲液
100 mM Tris 7.5
50 mM NaCl
10 mM BME（现用现加）
蛋白酶抑制剂（现用现加）

4X 上样缓冲液
2X TAE
20% 甘油
8% SDS
溴酚蓝（按需添加）

讨论

SDD-AGE 最初由 Kryndushkin 等人¹报道，用于研究酵母中[PSI+]朊病毒的SDS抗性复合物，此后已广泛应用于朊病毒和非朊病毒聚集体的研究^2-9。然而，蛋白质在琼脂糖凝胶电泳后转移至膜上的过程存在问题，可能导致印迹图像扭曲⁵。此外，最常用的浸没式电转印技术对凝胶尺寸存在实际限制，从而限制了可处理的样品数量。我们通过采用向下毛细管转移法¹⁰解决了这些问题，该方法是一种简单流程，利用一叠干燥的印迹纸将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜。毛细管转移可防止图像扭曲，并便于处理大尺寸凝胶。在使用 SDD-AGE 前需考虑几个要点。对于粗提样品（例如裂解液），必须进行特异性蛋白质的免疫检测。SDD-AGE 不能完全变性目标蛋白复合物，因此待检测的蛋白质必须在淀粉样形成区域之外带有表位标签。裂解液的制备通常可按照常规 SDS-PAGE 的方法进行，但有两个重要区别。首先，必须更加注意防止蛋白酶降解。此处使用的部分变性条件不足以灭活蛋白酶，还可能使目标蛋白更易被蛋白酶降解。应使用完整的蛋白酶抑制剂混合物，浓度至少为推荐浓度的两倍。其次，应避免加热样品。如果需要全单体阴性对照（例如用于确认高分子量物种并非由共价修饰引起），可在 95°C 下孵育 10 分钟，这通常可使大多数淀粉样蛋白恢复为单体形式。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
zymolyase 100T	Seikagaku Corporation	120493-1
Halt 蛋白酶抑制剂混合物	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78429
Hybond-C extra 硝酸纤维素膜	Amersham	RPN303E
GB004 印迹纸	Whatman, GE Healthcare	10427926
GB002 (3MM Chr) 印迹纸	Whatman, GE Healthcare	3030-917
琼脂糖（UltraPure）	Invitrogen	15510-027