本实验方法的完整文字方案可在<a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ]">《细胞生物学实验指南》</a>中获取。

作者无任何利益冲突需要披露。

非洲爪蟾卵提取物的制备与分级分离

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

粗制及分级的非洲爪蟾卵母细胞提取物可用于重建细胞过程，以进行形态学和生物化学分析。通过卵细胞裂解和差速离心法制备粗制提取物，进而用于制备分级提取物和轻质膜组分。

粗制和分级的非洲爪蟾卵提取物可用于提供重建细胞过程所需的组分，以进行形态学和生物化学分析。通过卵细胞裂解及差速离心法制备粗制提取物，进而用于制备分级提取物和轻质膜组分。

粗制及分级的非洲爪蟾卵提取物可用于提供重组细胞过程所需的组分，以进行形态学和生物化学研究。

在之前的视频中，我们演示了如何从成熟的 XUS labis 雌性个体中获取并去除卵子的胶状物质。这些卵子的粗提物可为体外重建细胞事件（如细胞核组装、核蛋白输入以及 DNA 复制）提供有用的细胞质和细胞器材料。大家好，我叫 Marie Cross，是佐治亚州亚特兰大市埃默里大学细胞生物学系 Maureen Power 博士实验室的一名研究生。今天我们将向您展示如何将卵提取物分离为可溶性胞质组分和轻膜组分。该过程包括以下步骤：裂解卵细胞、收集粗提物、对粗卵提取物进行分级分离、收集胞质提取物以及收集卵提取物的轻膜组分。现在让我们开始。首先，在卵裂解前裂解卵并收集粗提物。需通过折断巴氏吸管并小心地将断裂端插入吸头中来制作转移吸管。将卵转移至一个15毫升的聚丙烯管中。需要使用宽口移液管以避免卵子破裂。接着，将卵子离心30秒。在临床离心机中以400 × g离心，通过抽吸去除压紧卵子上层的卵缓冲液。记录卵的压实体积。根据此体积，将抑肽酶和瘦素溶液以及细胞因子B直接加在卵的上层，使用浓度为5毫克/毫升的储备液，使其终浓度为每毫升5微克；同时加入环孢素，使用10毫克/毫升的储备液，使其终浓度为每毫升50微克。抑肽酶和瘦素可抑制蛋白酶活性。细胞因子B抑制肌动蛋白聚合，环醇抑制蛋白质合成。现在将卵在4摄氏度下，使用Sova HB4摆桶转子，于12,000 G离心15分钟以裂解。裂解后的卵将分为三层。顶部为黄色脂质层，中间为粗提物，底部为深色沉淀。使用连接三毫升注射器的18号针头刺穿聚丙烯管侧壁，移除粗提物。粗提物包含细胞核和细胞质组分、内质网的轻质膜、核膜、核糖体以及包括线粒体在内的重膜细胞器。提取物可在冰上保存一至两个小时。我刚刚向您演示了如何从 opus lavis 卵中制备粗提物。需要牢记的是，这些提取物一旦经过冷冻和解冻，除非已被分离为胞质组分和轻膜组分，否则将无法支持核组装。现在我将向您演示具体操作步骤。开始进行分级分离时，将粗制卵母细胞提取物转移至一个 2.5 毫升的 UltraClear 离心管中。在 4°C 条件下，使用 Beckman TLS 100 离心机配备 TLS 55 转子，以 55,000 转/分钟（或 250,000 ×g）离心卵母细胞提取物 90 分钟。离心后，提取物会分为清晰的可溶部分和淡黄色的膜组分。在轻质膜下方，会有一层深色的膜组分，主要由线粒体和其他细胞器构成。底部为含有核糖体和糖原的大量组分，提取物需保持在冰上。使用截断的200微升移液器吸头移除澄清的可溶性上清液。注意不要扰动浅色的膜层，保留膜层中的胞质组分，并置于冰上。接下来，将可溶性组分转移至新的2.5 mL UltraClear离心管中，在4°C条件下以250,000 ×g离心25分钟。离心后，再次收集上层可溶性组分，将其分装为每份100微升的等分试样，用液氮速冻后于-80°C保存

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

制备及分馏爪蟾卵提取

Emory University.  原油和分馏的爪蟾卵提取物可用于提供重组细胞形态学和生化分析过程成分。蛋裂解和差速离心法是用来准备这又用来准备分次提取和轻膜制剂的粗提取物。

Summary

粗制及分级的非洲爪蟾卵母细胞提取物可用于重建细胞过程，以进行形态学和生物化学分析。通过卵细胞裂解和差速离心法制备粗制提取物，进而用于制备分级提取物和轻质膜组分。

非洲爪蟾卵提取物的制备与分级分离

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