本视频介绍了在体外使用激光镊子操控培养神经元的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本文及视频中，我们描述了在体外研究成年视网膜神经元再生突起靶向偏好的实验方案。制备视网膜细胞培养物的步骤始于视网膜的解剖、消化和吹打分散，最终将分离的视网膜细胞接种于专为激光镊子实验设计的培养皿上。这些培养皿分为细胞黏附半区和细胞排斥半区。细胞黏附侧涂有一层Sal-1抗体，为细胞生长提供附着基质；其他类型的细胞可使用其他黏附基质。细胞排斥侧则涂覆一层薄薄的聚-HEMA。接种在聚-HEMA侧的细胞可被激光镊子捕获、移动，并放置于Sal-1侧的细胞旁，形成细胞配对。利用该技术，可构建任意大小的细胞群体。“激光镊子控制的微操作”意味着研究者可自主选择需移动的细胞，并能标准化细胞间的距离。由于激光束可穿透培养皿的透明表面，细胞的选择与定位均在封闭且无菌的环境中完成。细胞可通过视频延时成像进行监测，并可结合任何所需的细胞生物学技术使用。该技术可能有助于细胞间相互作用的研究。
方案
用于操控培养中分离细胞的光镊技术
光镊的捕获力源于光的动量（Ashkin, 1991；Ashkin et al., 1986）。尽管这些力能够轻松捕获悬浮状态的细胞，却无法移动已贴附于表面的细胞。因此，为了降低细胞被捕获位置处对培养皿的黏附性，需将盖玻片涂覆聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-2-hydroxyethylmethacrylate, poly-HEMA）（Sigma Chemical Co., St Louis, MO），这是一种无毒化合物，具有排斥细胞黏附的特性，此前已被用于内皮细胞黏附研究（Folkman and Moscona, 1978）。在培养皿的一半区域涂覆poly-HEMA，而另一半则涂覆支持细胞生长的基质。在本实验室中，Sal-1被用作培养蝾螈视网膜细胞的基质。以下将描述制备Sal-1和poly-HEMA包被培养皿的操作步骤：
培养皿的制备
- 用酸清洗盖玻片（#1 VWR Scientific Inc.，Media，PA）。选择此盖玻片是因为其厚度仅为0.1 mm，适用于聚焦激光所需的高数值孔径物镜。
- 为形成细胞排斥区域，将20 mg聚羟基甲基丙烯酸甲酯（poly-HEMA，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO）溶于1 ml 95%乙醇中，在室温下静置过夜。该溶液最好在配制后1个月内使用。
- 将盖玻片在无尘环境（如超净台）中近乎垂直地架起。
- 用200 μl移液器的塑料吸头在盖玻片顶部滴加一至两滴poly-HEMA溶液。每滴体积约为50–100 μl，应仅限于盖玻片的一半区域。由于倾斜角度较陡，液体将沿盖玻片表面流至底部，形成一层均匀的薄层poly-HEMA涂层。将涂有poly-HEMA的盖玻片在超净台中室温下干燥30–60分钟。
- 用细头笔在盖玻片边缘附近标记出涂有poly-HEMA的一侧。
- 在35 mm培养皿底部钻一个直径为1 cm的孔。
- 使用Sylgard 184（Dow Corning Co.，Midland，MI）将涂有poly-HEMA的盖玻片粘附于培养皿底部，使涂有poly-HEMA的一侧朝向培养皿内部。确保poly-HEMA涂层边缘穿过孔的中心。将培养皿置于无尘环境中室温干燥1–3天。
- 用金刚石笔在盖玻片外侧沿poly-HEMA涂层边缘划一条线，然后在其两侧约2 mm处垂直划两条相互交叉的线。两个交点作为参考点或定位标记，用于在显微镜载物台上重现培养皿的相同方向。
- 将培养皿在紫外线下灭菌过夜。
- 为形成细胞黏附的半侧培养区域，用Sal-1对未涂poly-HEMA的一半区域进行包被，Sal-1含有针对视网膜细胞膜制备的小鼠抗蝾螈抗体（由亚特兰大乔治亚州莫尔豪斯医学院Peter MacLeish博士慷慨提供；参见MacLeish等，1983）。 首先，在Sal-1侧加入约100 μl浓度为0.1 mg/ml的无菌山羊抗小鼠IgG抗体（Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，IN），注意避免液体溢至poly-HEMA侧。孵育3小时后去除抗体溶液。用无菌任氏液清洗该区域一至两次， 然后加入100 μl Sal-1上清液，注意避免液体流入培养皿的poly-HEMA侧。第一抗体可确保Sal-1以已知浓度进行包被。
- 将培养皿与Sal-1抗体在4°C下孵育过夜。
- 去除Sal-1抗体溶液，并用无菌任氏液冲洗该区域。在接种细胞前，向培养皿中加入2 ml培养基。
两栖类任氏液、无血清两栖类培养基以及用于酶消化的任氏液的成分见于 MacLeish 和 Townes-Anderson（1988）以及 Mandell 等（1993）的研究。
细胞培养物的制备
本视频中使用的细胞来源于光适应的成年水生期虎纹蝾螈（Ambystoma tigrinum），体长为17–22 cm（Charles Sullivan Inc.，纳什维尔，田纳西州），在5°C条件下维持12小时光照与12小时黑暗的循环周期。实验方案经新泽西医科大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的指导方针。视网膜细胞培养的制备步骤由 Nachman-Clewner 和 Townes-Anderson（1996）描述，具体如下：
- 处死动物并进行断头和毁髓操作。摘除眼睛，并分离出角膜和虹膜。此时视网膜应在眼杯内轻微脱离。将弯镊置于视网膜下方，将其完整刮出。此阶段晶状体是否附着于视网膜上并不重要。
- 将视网膜置于含14 U/ml木瓜蛋白酶（papain，Worthington，Freehold，NJ）的蝾螈任氏液中消化40分钟。
- 使用前，木瓜蛋白酶任氏液应先用95% O2 / 5% CO2 混合气体饱和30分钟，然后经0.22微米滤膜（Millipore，Carrigtwohill，爱尔兰）过滤除菌。
- 用无菌的蝾螈任氏液冲洗视网膜三次。
- 将晶状体从任氏液中取出，然后用孔径为3 mm的移液管轻柔吹打视网膜组织，以获得单细胞悬液。
使用光镊操控分离的神经元
- 将培养皿放置在显微镜载物台上，通过将培养皿上的标记与载物台上的参考点对齐来确定其方向。将基准点的坐标保存在计算机中。
- 将细胞接种到培养皿的 Sal-1 和 poly-HEMA 两半区域上。
- 让细胞沉降约 20 分钟，时间足以使培养皿黏附侧的细胞附着于抗体基质上。
- 在培养皿的 Sal-1 黏附侧选择一个细胞，并标记靠近该细胞位置的 x 和 y 轴载物台坐标。在本实验中，该点距离所选细胞的主要树突约 10µm。将坐标保存在计算机中。
- 在培养皿的 poly-HEMA 侧选择第二个神经元，在本实验中为光感受器，并使用激光镊子工具捕获该细胞。 激光可在较宽的功率范围内实现捕获，但我们设定激光功率为 10%–20%，此功率足够低，可避免同时捕获杂质，但又足以在培养基中运输细胞。
- 在保持细胞被捕获的同时，降低载物台，使细胞位于培养皿表面之上，并高于任何已附着的神经元。通过计算机控制移动载物台，将细胞移至之前保存的 Sal-1 侧的 x 和 y 坐标位置。载物台移动速度设定为 8–20µm/s，但最大速度应通过实验确定。当到达 Sal-1 侧的目标位置后，升高载物台，使被捕获的细胞接近培养皿表面。细胞定位的精度可达数微米。让细胞黏附于 Sal-1 基质上。
- 在细胞配对前后获取成对细胞的数字化图像，可提供有用的记录。
- 将细胞对置于培养箱中维持培养。对于蝾螈细胞，将培养皿置于 10°C 的湿润培养室中。可通过视频延时成像监测细胞，并结合任何所需的细胞生物学技术进行使用。
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讨论
光具有动量，当光束穿过细胞时发生折射，改变动量方向需要施加一个力。根据动量守恒定律，必然会产生一个方向相反的反作用力作用于细胞上。Ashkin（1991年）证明，通过显微镜物镜聚焦的激光束所产生的力可使细胞向焦点中心移动。尽管激光束仅产生几皮牛顿的力，但该力已足以在培养基中拉动细胞。为避免对细胞造成损伤，通常采用水吸收较弱的近红外波长（Liu 等，1995年）。我们实验室使用的激光镊子工作站（Cell Robotics 公司，美国新墨西哥州阿尔伯克基）采用波长为980 nm、功率为1 W的连续波二极管激光器。激光通过一个高数值孔径（N.A. 1.3）的40倍油浸平场新荧光物镜（Carl Zeiss 公司）传输至细胞，该物镜将激光束聚焦在与显微镜同一焦平面上。
与随机铺板细胞的研究相比，激光镊子控制的微操作具有多项优势。例如，可以将细胞放置在彼此之间所需的特定距离上，并且该距离可在所有被操作细胞中保持标准化。此外，激光束穿过培养皿的透明表面，因此细胞操作是在一个封闭且无菌的环境中进行的。激光产生的力非常微弱，这限制了可被捕获的对象范围。根据我们的经验，细胞黏附性和细胞形态是影响成功...
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 EY012031 和 EY0182175，以及 F.M. Kirby 基金会提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 mm 圆形 1 号盖玻片 | VWR international | 48380 080 | |
| 聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA） | Sigma-Aldrich | P-3932 | 溶于 95% 乙醇 |
| 山羊抗小鼠 IgG 抗体 | Chemicon International | AP181 | 1 mg 溶于 1 ml，使用时稀释 10 倍 |
| 含小鼠抗蝾螈抗体的 Sal-1 上清液 | 由 Peter MacLeish 博士慷慨提供 | Peter MacLeish 博士，莫尔豪斯医学院，亚特兰大，佐治亚州，美国 | |
| 3 mm 内径 5 ml 吡rex 一次性移液管 | Corning | 7078A-5 | |
| 细胞培养皿 35 mm × 10 mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | ||
| 光镊-微操作工具或激光镊子 | Cell Robotics Inc. | ||
| 波长 980 nm 的 1 W 连续波二极管激光器 | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 倒置光学显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40 倍油浸 Plan-Neofluor 物镜 | Carl Zeiss, Inc. | 数值孔径（N.A. 1.3） | |
| 黑白 CCD 摄像头 | Sony Corporation | ||
| 配备软件的计算机和操纵杆 | Cell Robotics Inc. | 用于控制电动载物台 |
参考文献
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
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