利用基于荧光素酶的报告基因检测法研究膜生物发生

摘要

本文介绍了利用Promega的Dual-Glo™ Luciferase Assay System，通过基于荧光素酶的报告基因方法研究吞噬作用诱导的基因表达变化的实验步骤。

摘要

为研究膜生物合成过程中不同脂质合成途径的协调作用，采用一种膜生物合成快速且可诱导的实验系统十分有益。我们发现，吞噬乳胶微球是一种适用于此目的的实用方法，因为细胞在颗粒吞噬过程中会迅速合成膜脂，以补充因包裹颗粒而消耗的膜成分。本文中，我们描述了利用普洛麦格（Promega）的Dual-Glo® Luciferase Assay System，通过基于荧光素酶的报告基因方法研究吞噬作用诱导的基因表达变化的实验步骤。 关键词：脂质合成，膜生物合成，吞噬作用，乳胶微球，荧光素酶报告基因，Dual-Glo® Luciferase Assay System，基因表达

方案

细胞培养

1. 人胚胎肾293（HEK293）细胞的储备培养物在含有“培养基A”的10 cm培养皿中培养，培养基A由添加了抗生素混合液（每毫升含100单位青霉素和每毫升含100 µg硫酸链霉素）和10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）组成。
2. 实验前准备细胞时，吸去培养基，用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液洗涤细胞两次。
3. 随后移除 PBS，并加入 0.6 ml 含 0.25% 胰蛋白酶的溶液。
4. 将培养皿在37˚C孵育约2分钟，直至细胞开始脱落。
5. 加入5.5 ml 培养基A以中和胰蛋白酶，随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。
6. 将细胞稀释至每毫升320,000个细胞，然后每孔加入0.1毫升，接种于多聚赖氨酸包被的96孔培养板中。
7. 将培养皿放入37˚C、含8.8% CO2的组织培养孵箱中，培养24小时。

转染

1. 在准备转染实验时，应考虑每个实验条件需要设置多少个重复，以及每个样品转染的质粒用量。我们通常每个条件设置三个重复，每孔转染50至100 ng质粒DNA。质粒混合物中应至少包含一个表达萤火虫荧光素酶的报告基因载体，以及一个由组成型启动子驱动表达海肾荧光素酶的对照质粒。
2. 将质粒溶液加入1.5 ml微量离心管中，并为每个样品补充10 µl无血清且无抗生素的DMEM。例如，若需对20个孔中的每个孔转染50 µg DNA，则将200 µl DMEM加入1 µg DNA中。
3. 向DMEM/DNA溶液中每1 µg DNA加入3 µl ‘TransIT 293试剂’（Mirus），用移液器吹打混匀 & 静置，让样品在室温下静置至少10分钟。
4. 在此期间，从96孔培养板中移除培养基，并加入90 µl新鲜的培养基A。
5. 向每个孔中加入 10 µl 的 DMEM/DNA/TransIT 293 混合物。
6. 将培养皿放入37˚C、含8.8% CO2的组织培养孵箱中，培养24小时。

吞噬作用

1. 制备含有培养基B（DMEM与Ham’s F12培养基1:1混合，添加抗生素和10%胎牛血清）的悬浮液，并加入0至1 mg/mL的0.75-µm乳胶微球。
2. 从96孔培养板中移除培养基，加入0.1 ml含介质B的珠悬浮液。
3. 以1000 × g离心2分钟。
4. 细胞随后在37˚C培养6至16小时。根据所使用的条件和驱动荧光素酶的启动子不同，可在1至3小时后检测到报告基因表达的增加。
5. 在某些情况下，可能需要将细胞与微珠共同孵育30至60分钟，然后用PBS洗涤两次以去除未结合的微珠，再加入新鲜培养基，继续孵育细胞一段时间。

Dual-GloTM 荧光素酶检测

1. 注意：本实验所用试剂盒的操作步骤在某些方面与制造商推荐的方案有所不同，已进行修改以减少每个样品所需的试剂用量。
2. 配制1 M DTT溶液，分装成多个小份，于-20˚C保存。
3. 配制裂解缓冲液，含20 mM Tris-HCl（pH 7.8）、10%（v/v）甘油和0.5%（v/v）Triton X-100。使用前，根据实验所需量分装，并每毫升加入1 µl的1 M DTT以及蛋白酶抑制剂混合物，使其终浓度为0.5至1倍。剩余的DTT溶液不得重复使用。
4. 首次使用Dual-GloTM试剂盒时，将一瓶Dual-GloTM Luciferase Buffer（试剂盒提供）的全部内容物转移至一瓶Dual-GloTM Luciferase Substrate（试剂盒提供）中，配制成荧光素酶试剂。将未使用的荧光素酶试剂分装为每份10 ml，于-20˚C保存。
5. 从组织培养孵箱中取出96孔板，置于冰上。吸除培养基，每孔加入40 µl裂解缓冲液，然后将板继续置于冰上30分钟。
6. 在白色不透明96孔板（OptiplateTM-96，Perkin Elmer货号6005290）中，每孔分装15 µl荧光素酶试剂，然后每孔加入15 µl细胞裂解液。
7. 室温孵育10分钟，随后在酶标仪中读取发光信号。
8. 使用前立即按1份Dual-GloTM Stop & Glo® Reagent（试剂盒提供）与100份Dual-GloTM Stop & Glo® Buffer（试剂盒提供）的比例配制适量的海肾荧光素酶底物溶液。
9. 向每孔加入15 µl海肾荧光素酶底物溶液，室温孵育10分钟，然后再次测定发光信号。