利用基于荧光素酶的报告基因检测法研究膜生物发生

摘要

本文介绍了利用Promega的Dual-Glo™ Luciferase Assay System，通过基于荧光素酶的报告基因方法研究吞噬作用诱导的基因表达变化的实验步骤。

摘要

为研究膜生物合成过程中不同脂质合成途径的协调作用，采用一种膜生物合成快速且可诱导的实验系统十分有益。我们发现，吞噬乳胶微球是一种适用于此目的的实用方法，因为细胞在颗粒吞噬过程中会迅速合成膜脂，以补充因包裹颗粒而消耗的膜成分。本文中，我们描述了利用普洛麦格（Promega）的Dual-Glo® Luciferase Assay System，通过基于荧光素酶的报告基因方法研究吞噬作用诱导的基因表达变化的实验步骤。 关键词：脂质合成，膜生物合成，吞噬作用，乳胶微球，荧光素酶报告基因，Dual-Glo® Luciferase Assay System，基因表达

方案

细胞培养

1. 人胚胎肾293（HEK293）细胞的储备培养物在含有“培养基A”的10 cm培养皿中培养，培养基A由添加了抗生素混合液（每毫升含100单位青霉素和每毫升含100 µg硫酸链霉素）和10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）组成。
2. 实验前准备细胞时，吸去培养基，用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液洗涤细胞两次。
3. 随后移除 PBS，并加入 0.6 ml 含 0.25% 胰蛋白酶的溶液。
4. 将培养皿在37˚C孵育约2分钟，直至细胞开始脱落。
5. 加入5.5 ml 培养基A以中和胰蛋白酶，随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。
6. 将细胞稀释至每毫升320,000个细胞，然后每孔加入0.1毫升，接种于多聚赖氨酸包被的96孔培养板中。
7. 将培养皿放入37˚C、含8.8% CO2的组织培养孵箱中，培养24小时。

转染

1. 在准备转染实验时，应考虑每个实验条件需要设置多少个重复，以及每个样品转染的质粒用量。我们通常每个条件设置三个重复，每孔转染50至100 ng质粒DNA。质粒混合物中应至少包含一个表达萤火虫荧光素酶的报告基因载体，以及一个由组成型启动子驱动表达海肾荧光素酶的对照质粒。
2. 将质粒溶液加入1.5 ml微量离心管中，并为每个样品补充10 µl无血清且无抗生素的DMEM。例如，若需对....