背根神经节神经元在隔室化培养中的制备与维持

摘要

本文介绍了制备和维护隔室化培养室以培养背根神经节感觉神经元的技术。

摘要

神经元延伸出远离胞体的轴突，以支配靶组织，在这些靶组织中，靶源性生长因子对神经元的存活和功能至关重要。神经营养因子对于维持支配性感觉神经元的存活和分化尤为必要，但这些靶源性神经营养因子如何将信号传递至支配神经元胞体的问题，过去30多年来一直是活跃的研究领域。目前最广为接受的神经营养因子信号传递至胞体的模型认为，信号内体通过轴突进行逆行运输，携带该信号。为了研究逆行运输，Robert Campenot 最初设计了一种培养系统，使神经元胞体与其轴突相互隔离。这种用于培养感觉神经元的隔室化培养室制备技术，可重现靶源性神经营养因子释放后在体内发生的神经元末梢选择性刺激过程。需要长距离微管依赖性逆行运输的逆行信号事件，对于神经退行性疾病的治疗具有重要意义。

方案

试剂的准备

1. 胶原蛋白包被：用胶原蛋白包被 p35 组织培养板，并在 37°C 烘箱中孵育 2 天，之后再涂抹分隔器。胶原蛋白的终浓度应为 0.71 mg/mL，用 0.001N HCl 稀释。然后每板加入 1 mL 混合液。
2. 涂抹加样器：为填充润滑加样器，需先用 60 mL 注射器吸取 Corning 真空润滑脂。使用该注射器将润滑脂注入加样器中，用铝箔包裹后，于高压灭菌器中灭菌 45 分钟。
3. 聚四氟乙烯（Teflon）分隔器：每次实验后分隔器可重复使用，但必须彻底清洗。从培养板中取出分隔器，擦去所有残留润滑脂，然后置于硫酸中浸泡 2 天。从酸中取出后，用水冲洗 3 次，煮沸 20 分钟，晾干后放入玻璃 p100 培养皿中，高压灭菌 20 分钟。
4. N2-甲基纤维素：称取 1.5 g 甲基纤维素，放入 500 mL 瓶中。加入搅拌子，在干燥条件下高压灭菌 20 分钟（此后所有操作均需无菌）。接着加入 500 mL 无血清培养基（N₂），在冷室中搅拌至完全溶解。分装至 50 mL 锥形管中，于 -20°C 冻存。工作液制备时，将其中一管 50 mL 溶液分装至 1 mL 离心管中，于 -20°C 冻存。
5. DRG 培养基：DMEM，5% 热灭活马血清，1% 青霉素-链霉素。
6. 100 ng/mL DRGN 培养基：神经生....

讨论

在本视频中，我们演示了如何制备和维护用于培养背根神经节（DRG）神经元的隔室化培养装置。若操作得当，该系统可将细胞体与轴突分离，从而研究神经营养因子在长距离轴突上传导信号的机制。由于各隔室之间具有流体隔离性，因此可对某一隔室进行选择性刺激或处理，而不会影响其他隔室。隔室化培养装置还可支持其他多种细胞类型的培养，包括来自颈上神经节的交感神经元、视网膜神经节细胞以及皮层神经元。对神经营养因子信号转导空间特性的理解，可能为神经退行性疾病的治疗提供新的见解。多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、亨廷顿病和运动神经元病，均与轴突运输功能障碍相关。近期研究已采用微流控装置替代此类隔室化培养装置。微流控装置^4,5在成像分析方面具有多项优势。

既往研究已检测了这些培养物阻止轴突与胞体区室间扩散的能力^1,3,6。可通过仅向一个区室中添加低浓度染料（如台盼蓝）并观察染料是否扩散来轻松检测。在24小时内应几乎看不到或完全看不到扩散现象。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原蛋白	试剂	BD Biosciences	354249
N2-甲基纤维素 400CPS	试剂	Sel-Win Chemicals
特氟龙隔板	其他	Tyler Research	CAMP10	市面上可提供多种类型的隔板
排针耙	工具	Tyler Research	Camp-PR
润滑脂加样器	工具	Tyler Research	Camp-GLSS
DMEM	试剂	Fisher Scientific	MT10017CV
NGF	试剂	PeproTech Inc	450-01
BDNF	试剂	PeproTech Inc	450-02
高真空润滑脂	试剂	Fisher Scientific	14-635-5D
AraC	试剂	Sigma-Aldrich	C-1768
23号鲁尔接头短管	工具	Fisher Scientific	427565
90° 角止血钳	工具	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-7035