本文介绍了制备和维护隔室化培养室以培养背根神经节感觉神经元的技术。
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本文内容
摘要
摘要
神经元延伸出远离胞体的轴突，以支配靶组织，在这些靶组织中，靶源性生长因子对神经元的存活和功能至关重要。神经营养因子对于维持支配性感觉神经元的存活和分化尤为必要，但这些靶源性神经营养因子如何将信号传递至支配神经元胞体的问题，过去30多年来一直是活跃的研究领域。目前最广为接受的神经营养因子信号传递至胞体的模型认为，信号内体通过轴突进行逆行运输，携带该信号。为了研究逆行运输，Robert Campenot 最初设计了一种培养系统，使神经元胞体与其轴突相互隔离。这种用于培养感觉神经元的隔室化培养室制备技术，可重现靶源性神经营养因子释放后在体内发生的神经元末梢选择性刺激过程。需要长距离微管依赖性逆行运输的逆行信号事件，对于神经退行性疾病的治疗具有重要意义。
方案
试剂的准备
- 胶原蛋白包被：用胶原蛋白包被 p35 组织培养板，并在 37°C 烘箱中孵育 2 天，之后再涂抹分隔器。胶原蛋白的终浓度应为 0.71 mg/mL，用 0.001N HCl 稀释。然后每板加入 1 mL 混合液。
- 涂抹加样器：为填充润滑加样器，需先用 60 mL 注射器吸取 Corning 真空润滑脂。使用该注射器将润滑脂注入加样器中，用铝箔包裹后，于高压灭菌器中灭菌 45 分钟。
- 聚四氟乙烯（Teflon）分隔器：每次实验后分隔器可重复使用，但必须彻底清洗。从培养板中取出分隔器，擦去所有残留润滑脂，然后置于硫酸中浸泡 2 天。从酸中取出后，用水冲洗 3 次，煮沸 20 分钟，晾干后放入玻璃 p100 培养皿中，高压灭菌 20 分钟。
- N2-甲基纤维素：称取 1.5 g 甲基纤维素，放入 500 mL 瓶中。加入搅拌子，在干燥条件下高压灭菌 20 分钟（此后所有操作均需无菌）。接着加入 500 mL 无血清培养基（N2），在冷室中搅拌至完全溶解。分装至 50 mL 锥形管中，于 -20°C 冻存。工作液制备时，将其中一管 50 mL 溶液分装至 1 mL 离心管中，于 -20°C 冻存。
- DRG 培养基：DMEM，5% 热灭活马血清，1% 青霉素-链霉素。
- 100 ng/mL DRGN 培养基：神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的储存液浓度均为 1 mg/mL。将两种神经营养因子分别按 1:10,000 比例稀释至 DRG 培养基中。培养物可仅使用 NGF；这会改变在培养物中存活的神经元类型组成。
注意：如需使用，阿糖胞苷（cytosine arabinoside, AraC）的储存浓度为 1 μM，工作终浓度为 0.3 μM，可抑制施万细胞及其他胶质细胞的生长。 - 10 ng/mL DRGN 培养基：将 100 ng/mL DRGN 培养基用 DRG 培养基按 1:10 比例稀释。
图 1. 安装所需工具
设置隔室培养室（在解剖前1-2天开始此步骤）
- 在胶原蛋白包被的 p35 培养皿中央，向外划一道划痕。
- 在划痕中央放置30 μl的N2-甲基纤维素。将培养皿放置一旁，直至隔板涂好油脂。
- 将23号规格鲁尔接头连接到润滑脂加载器上。用一对90°弯止血钳夹住聚四氟乙烯分隔片，在显微镜下将其平放，分隔面朝上。用润滑脂沿分隔片边缘描迹，确保每次将接头置于新的起始位置时，均将其插入前一步骤留下的润滑脂中，以形成连续的润滑脂线（见示意图）。当润滑脂完全覆盖整个分隔片后，将一个预先准备好的p35培养皿倒置，使其N2-甲基纤维素面覆盖在中间隔室上方，用镊子按压培养皿底部。务必在分隔片内侧的四个角（左上、右下、右上、左下，示意图中以“X”标示）进行按压。
图2润滑分隔器的步骤
注意：按压的力度需足够大，以确保硅脂与培养皿之间形成完整密封，但若压力过大，轴突将无法进入侧室。
用止血钳夹起培养皿，翻转后松开分隔板。最后，将分隔板牢固固定的培养皿置于显微镜下，聚焦于中间腔室的底部。使用润滑剂加样器在中间腔室周围形成一道小屏障（0.25 cm），以防止细胞加入中间腔室后泄漏。 - 在建立多个培养体系后，将DRG培养基加入每个侧室中，并将装置放入细胞培养箱中进行维持。让培养体系静置数小时后，检查是否有泄漏。如果培养基已渗入中间室，则该培养体系不可用。
注意初次学习该技术时，应建立比实验所需数量更多的培养体系，因为其中部分会出现泄漏现象。
图3“良好”与“渗漏”培养
在隔室化培养中维持背根神经节神经元
- 第1天：用含100 ng/mL DRGN和AraC的培养基替换侧区的DRG培养基。进行解剖并将细胞加入中央区室（100,000个细胞）。
- 第2天：向特氟龙隔板外侧加入含10 ng/mL AraC的培养基，直至培养基漫过油脂屏障，并与中央隔室进行液体交换。
- 第3天：在侧室中更换为含100 ng/mL DRGN但不含AraC的培养基，在周围区域更换为含10 ng/mL DRGN但不含AraC的培养基。
- 第6天：将侧室中的培养基更换为含 1 ng/mL + AraC 的培养基，周围区域更换为含 DRG 培养基 + AraC 的培养基。
- 第9天：用于实验。
图4免疫组化图像中的细胞体与远端轴突
注意：更换培养基时，务必从每个侧室的上部吸出液体。此外，切勿直接更换中央室的培养基，只能更换周围侧室的培养基，让培养基通过油脂屏障自然流入中央室。
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讨论
在本视频中，我们演示了如何制备和维护用于培养背根神经节（DRG）神经元的隔室化培养装置。若操作得当，该系统可将细胞体与轴突分离，从而研究神经营养因子在长距离轴突上传导信号的机制。由于各隔室之间具有流体隔离性，因此可对某一隔室进行选择性刺激或处理，而不会影响其他隔室。隔室化培养装置还可支持其他多种细胞类型的培养，包括来自颈上神经节的交感神经元、视网膜神经节细胞以及皮层神经元。对神经营养因子信号转导空间特性的理解，可能为神经退行性疾病的治疗提供新的见解。多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、亨廷顿病和运动神经元病，均与轴突运输功能障碍相关。近期研究已采用微流控装置替代此类隔室化培养装置。微流控装置4,5在成像分析方面具有多项优势。
既往研究已检测了这些培养物阻止轴突与胞体区室间扩散的能力1,3,6。可通过仅向一个区室中添加低浓度染料（如台盼蓝）并观察染料是否扩散来轻松检测。在24小时内应几乎看不到或完全看不到扩散现象。
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致谢
我们感谢 Katharina Cosker 和 Stephanie Courchesne 的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 胶原蛋白 | 试剂 | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-甲基纤维素 400CPS | 试剂 | Sel-Win Chemicals | ||
| 特氟龙隔板 | 其他 | Tyler Research | CAMP10 | 市面上可提供多种类型的隔板 |
| 排针耙 | 工具 | Tyler Research | Camp-PR | |
| 润滑脂加样器 | 工具 | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | 试剂 | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | 试剂 | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | 试剂 | PeproTech Inc | 450-02 | |
| 高真空润滑脂 | 试剂 | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | 试剂 | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23号鲁尔接头短管 | 工具 | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° 角止血钳 | 工具 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
参考文献
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
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