新生儿缺血性缺氧性脑病的围产期缺血模型

摘要

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型是研究人类新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的一种成熟模型。本文描述了新生大鼠幼崽中HIE模型的建立方法。

摘要

缺氧缺血性脑病（HIE）是围产期窒息所致的后果。25%的HIE新生儿会发展为严重的永久性神经心理后遗症，包括智力障碍、脑瘫和癫痫。HIE的结局极为严重且不可逆，因此迫切需要识别并开发有效的治疗策略，以减轻HIE新生儿的脑损伤。为此，研究人员建立了新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤模型，以模拟人类这一病理状态。该HIE模型最早由Vannucci等人¹验证，并已被广泛用于研究围产期缺氧-缺血所致脑损伤的机制²，以及评估潜在的治疗干预手段^3,4。HIE模型分为两个步骤：首先结扎左侧颈总动脉，随后将动物暴露于低氧环境中。由于 Willis 环提供的侧支循环，结扎侧半球的脑血流量（CBF）在常氧状态下不会显著下降；但在低氧条件下，同侧半球的CBF显著减少，从而导致单侧缺血性脑损伤。使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色以标记和识别缺血脑组织，最初是为成年啮齿类动物脑缺血模型开发的⁵，现常用于评估缺血事件后72小时内早期脑梗死范围⁶。在本视频中，我们演示了新生大鼠脑缺氧缺血性损伤模型的建立，以及通过TTC染色评估脑梗死面积的方法。

方案

本方案已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会的批准，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南。

新生大鼠缺氧缺血性脑病模型

1. 出生后第7天（PND 7）的Sprague-Dawley大鼠幼崽（Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA）使用异氟烷（Aerrane, Baxter, Deerfield, IL；诱导浓度3-4%，维持浓度1-2%）进行完全麻醉。
2. 在颈部做一小切口（Extra Thin Iris Scissors #14088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA），以暴露左侧颈总动脉（CCA）。
3. 使用5-0丝线（5-0 silk, Ethicon, Somer, NJ）结扎颈总动脉。
4. 用氰基丙烯酸酯粘合剂（Elmers Products Inc, Columbus, OH）闭合切口，覆盖胶带后停止麻醉。将幼崽放回母鼠身边，恢复1-2小时。
5. 随后将幼崽置于一个含有8%氧气和92%氮气的低氧舱中，在37°C条件下持续100分钟。8%氧气/92%氮气混合气体（Airgas, Sacramento, CA）通过导管流入配备塑料盖的小鼠笼中。该盖子与笼子紧密贴合，上有两个直径为2 cm的孔，其中一个用于连接8%氧气气源管，另一个用于排出气体。将低氧舱置于水浴中，使用前预热，....

讨论

啮齿类动物出生后缺氧缺血性脑病（HIE）模型是一种成熟的模型，可重现新生儿围产期发生的脑缺氧情况。大量组织学和免疫细胞化学表征研究表明，出生7天的啮齿类动物大脑发育成熟度与人类胎儿第三孕期相当⁷。该啮齿类HIE模型在揭示围产期缺氧所致脑损伤机制方面具有重要价值²，一些干预措施（如低温疗法）已在该模型中得到验证³。该模型最初在大鼠中建立，近年来已成功应用于小鼠⁸。

有一些特定的技术细节需要说明：

1. 结扎颈总动脉（CCA）前，务必清除可能缠绕CCA的结缔组织和迷走神经。成功结扎后，结扎部位上方的血管颜色应变为白色。也可采用双重结扎法，即在两个结扎点之间剪断血管。将幼鼠放回母鼠身边之前，应用标签胶带覆盖结扎侧切口。
2. 每只幼鼠的麻醉时间最长不应超过10分钟，以确保CCA结扎操作顺利并获得理想的实验结果。
3. CCA结扎后的恢复期应为90–120分钟。若时间过短，幼鼠存活率降低；若时间过长，则梗死范围变异性增大，且倾向于形成较小的梗死灶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
斯普拉格-道利大鼠幼崽	动物	Charles River Laboratories
异氟烷	手术	Baxter Internationl Inc.
8% 氧气 / 92% 氮气	手术	Airgas
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	试剂	Sigma-Aldrich	T8877
磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4	试剂	GIBCO，由 Life Technologies 生产
多聚甲醛	试剂	Sigma-Aldrich	P6148