新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型是研究人类新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的一种成熟模型。本文描述了新生大鼠幼崽中HIE模型的建立方法。
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本文内容
摘要
摘要
缺氧缺血性脑病（HIE）是围产期窒息所致的后果。25%的HIE新生儿会发展为严重的永久性神经心理后遗症，包括智力障碍、脑瘫和癫痫。HIE的结局极为严重且不可逆，因此迫切需要识别并开发有效的治疗策略，以减轻HIE新生儿的脑损伤。为此，研究人员建立了新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤模型，以模拟人类这一病理状态。该HIE模型最早由Vannucci等人1验证，并已被广泛用于研究围产期缺氧-缺血所致脑损伤的机制2，以及评估潜在的治疗干预手段3,4。HIE模型分为两个步骤：首先结扎左侧颈总动脉，随后将动物暴露于低氧环境中。由于 Willis 环提供的侧支循环，结扎侧半球的脑血流量（CBF）在常氧状态下不会显著下降；但在低氧条件下，同侧半球的CBF显著减少，从而导致单侧缺血性脑损伤。使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色以标记和识别缺血脑组织，最初是为成年啮齿类动物脑缺血模型开发的5，现常用于评估缺血事件后72小时内早期脑梗死范围6。在本视频中，我们演示了新生大鼠脑缺氧缺血性损伤模型的建立，以及通过TTC染色评估脑梗死面积的方法。
方案
本方案已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会的批准，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南。
新生大鼠缺氧缺血性脑病模型
- 出生后第7天（PND 7）的Sprague-Dawley大鼠幼崽（Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA）使用异氟烷（Aerrane, Baxter, Deerfield, IL；诱导浓度3-4%，维持浓度1-2%）进行完全麻醉。
- 在颈部做一小切口（Extra Thin Iris Scissors #14088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA），以暴露左侧颈总动脉（CCA）。
- 使用5-0丝线（5-0 silk, Ethicon, Somer, NJ）结扎颈总动脉。
- 用氰基丙烯酸酯粘合剂（Elmers Products Inc, Columbus, OH）闭合切口，覆盖胶带后停止麻醉。将幼崽放回母鼠身边，恢复1-2小时。
- 随后将幼崽置于一个含有8%氧气和92%氮气的低氧舱中，在37°C条件下持续100分钟。8%氧气/92%氮气混合气体（Airgas, Sacramento, CA）通过导管流入配备塑料盖的小鼠笼中。该盖子与笼子紧密贴合，上有两个直径为2 cm的孔，其中一个用于连接8%氧气气源管，另一个用于排出气体。将低氧舱置于水浴中，使用前预热，并确保内部温度计显示为37°C后开始低氧处理。
- 低氧处理100分钟后，将幼崽再次放回母鼠身边进行恢复。
- 低氧处理结束后24小时，通过深度异氟烷麻醉处死幼崽。用冷生理盐水灌注脑组织，随后用冷的含1% TTC的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）灌注。TTC需避光保存。
- 取出脑组织并在冰上冷却1-2分钟，从视交叉和漏斗部水平开始（相当于成年小鼠脑的前囟1.8 ~ 2.0 mm水平），向后每隔3 mm切取4个冠状切片（水平1-4）。
- 将脑切片浸入TTC溶液中，在37°C孵育8分钟，随后在4%多聚甲醛/PBS中固定过夜。由于TTC对光敏感，此过程中应避免光照。
- 对TTC染色的切片进行扫描并数字化。使用Image J软件（NIH, Bethesda, MD）测量每个水平的梗死面积（未染色区域）、同侧半脑面积和对侧半脑面积。每片的梗死面积百分比计算公式为：（梗死面积 / 同侧半脑面积），即A1、A2、A3和A4。梗死体积百分比计算公式为：(A1 + A2 + A3 + A4) × 3 mm。皮层或纹状体损伤区域也可采用类似方法分别定量。
代表性结果
图1. 经TTC染色的代表性HIE冠状面切片1-4级。
TTC 染色的冠状切面显示梗死区域（呈白色）。
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讨论
啮齿类动物出生后缺氧缺血性脑病（HIE）模型是一种成熟的模型，可重现新生儿围产期发生的脑缺氧情况。大量组织学和免疫细胞化学表征研究表明，出生7天的啮齿类动物大脑发育成熟度与人类胎儿第三孕期相当7。该啮齿类HIE模型在揭示围产期缺氧所致脑损伤机制方面具有重要价值2，一些干预措施（如低温疗法）已在该模型中得到验证3。该模型最初在大鼠中建立，近年来已成功应用于小鼠8。
有一些特定的技术细节需要说明：
- 结扎颈总动脉（CCA）前，务必清除可能缠绕CCA的结缔组织和迷走神经。成功结扎后，结扎部位上方的血管颜色应变为白色。也可采用双重结扎法，即在两个结扎点之间剪断血管。将幼鼠放回母鼠身边之前，应用标签胶带覆盖结扎侧切口。
- 每只幼鼠的麻醉时间最长不应超过10分钟，以确保CCA结扎操作顺利并获得理想的实验结果。
- CCA结扎后的恢复期应为90–120分钟。若时间过短，幼鼠存活率降低；若时间过长，则梗死范围变异性增大，且倾向于形成较小的梗死灶。
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致谢
由美国心脏协会和美国出生缺陷基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 斯普拉格-道利大鼠幼崽 | 动物 | Charles River Laboratories | ||
| 异氟烷 | 手术 | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% 氧气 / 92% 氮气 | 手术 | Airgas | ||
| 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4 | 试剂 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | ||
| 多聚甲醛 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P6148 |
参考文献
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- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model. Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).
- Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome. Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).
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- Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).
- Grow, J., Barks, J. D. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).
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