方法文章

鸡胚整体免疫染色方法 关键词：鸡胚，整体染色，免疫荧光，抗体染色，发育生物学

DOI：

10.3791/956

⸱

2009年2月2日

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Center for Environmental and Genetic Medicine, Texas A&M University (TAMU)

本文内容

摘要

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本视频展示了整体免疫组织化学技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化抗原的空间和时间表达模式。该方法最初由 Jane Dodd 和 Tom Jessell 提出。

摘要

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鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易获取性以及易于操作的特点，使其成为研究发育中的脑、神经管和体节中抗体表达的理想工具。本视频演示了使用HRP标记的二抗进行整体抗体染色的各个步骤：首先，将鸡胚从蛋中解剖出来，并用多聚甲醛固定；其次，灭活内源性过氧化物酶；然后使鸡胚与一抗孵育。经过多次洗涤后，将鸡胚与HRP标记的二抗共同孵育。通过与二氨基联苯胺底物反应显色，揭示过氧化物酶的活性。最后，对鸡胚进行固定并进行拍照和切片处理。与荧光抗体法相比，该方法的优势在于鸡胚可进行石蜡切片，从而能够研究抗原位点的横切面分布。该方法最初由Jane Dodd和Tom Jessell建立。1.

方案

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一、示意图概述：

本视频展示了鸡胚整体免疫组织化学染色的各个步骤。首先，用PFA固定胚胎 [IHC1]；然后淬灭内源性过氧化物酶活性 [IHC2]；接着将胚胎与一抗孵育 [IHC3]；经过多次洗涤后，再与二抗孵育 [IHC4]；使用DAB显色 [IHC5]，抗体染色呈橙色 [IHC6]。

免疫组织化学流程图；抗体应用、染色、可视化步骤。

第1部分：胚胎固定

  1. 对鸡胚进行整体免疫组织化学染色时，首先用镊子轻敲蛋壳并移除部分蛋壳以打开鸡蛋。
  2. 用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。
  3. 使用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
  4. 在解剖显微镜下，小心去除胚胎周围的膜和残留卵黄，并将胚胎转移至另一含有新鲜PBS的培养皿中。
  5. 用镊子和昆虫针固定胚胎，吸除PBS，加入....

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讨论

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本视频展示了在小鸡胚胎中进行整体免疫染色的各个步骤。该方案主要用于在小鸡中对新型抗体进行时空特异性表征2,3，以及利用已知抗原标记物来确定损伤后引起的胚胎畸形4。

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致谢

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由（J. Dodd、T.M Jessell 和 A. Kawakami）开发的单克隆抗体（15.3B9、PAX7）购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库在NICHD的赞助下建立，并由爱荷华大学生物科学系（爱荷华州，爱荷华市）维护。D.P. 获得美国国家药物滥用研究所（National Institute on Drug Abuse）授予的露丝·柯什斯坦奖（Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1）。本工作由Margaret M. Alkek基金会资助给RHF。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鸡蛋Charles River Laboratories优质受精卵已受精，HH4期（16小时）
体视显微镜显微镜Leica MicrosystemsMZ9.5 或类似型号
Marsh自动孵育箱其他LyonRX
弯头镊子（1）工具Electron Microscopy Sciences72991-4C
直头镊子（2）工具Fine Science Tools11002-13
精细剪刀工具Fine Science Tools14161-10
塑料培养皿工具Falcon BD353001
橡胶吸头工具Electron Microscopy Sciences70980
巴斯德毛细移液管工具Electron Microscopy Sciences70950-12在火焰下将边缘烧圆
显微解剖刀工具Fine Science Tools10056-12用于固定后从周围膜结构中切下胚胎
Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础液试剂Dow Corning0001986475按1份固化剂与9份基础液混合；在37°C下过夜固化
16% PFA试剂Electron Microscopy Sciences15710
30% H2O2试剂Sigma-AldrichH1009
BSA试剂Sigma-AldrichA3803
NGS试剂Jackson ImmunoResearch005-000-121
一抗试剂发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）4G11, 15.3B9, PAX7针对这些抗体，研究人员使用了小鼠供体
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）试剂Jackson ImmunoResearch115-035-003
3,3’-四盐酸联苯胺（diaminobenzidine tetrahydrochloride）试剂Pierce, Thermo Scientific34001于-20°C保存；使用前将瓶恢复至室温
雪松油试剂Sigma-AldrichW522503
快绿FCF试剂Sigma-AldrichF7252
直径0.2 mm的昆虫针Fine Science Tools26002-20

参考文献

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  1. Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
  2. Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E.

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DAB

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