鸡胚整体免疫染色方法 关键词：鸡胚，整体染色，免疫荧光，抗体染色，发育生物学

摘要

本视频展示了整体免疫组织化学技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化抗原的空间和时间表达模式。该方法最初由 Jane Dodd 和 Tom Jessell 提出。

摘要

鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易获取性以及易于操作的特点，使其成为研究发育中的脑、神经管和体节中抗体表达的理想工具。本视频演示了使用HRP标记的二抗进行整体抗体染色的各个步骤：首先，将鸡胚从蛋中解剖出来，并用多聚甲醛固定；其次，灭活内源性过氧化物酶；然后使鸡胚与一抗孵育。经过多次洗涤后，将鸡胚与HRP标记的二抗共同孵育。通过与二氨基联苯胺底物反应显色，揭示过氧化物酶的活性。最后，对鸡胚进行固定并进行拍照和切片处理。与荧光抗体法相比，该方法的优势在于鸡胚可进行石蜡切片，从而能够研究抗原位点的横切面分布。该方法最初由Jane Dodd和Tom Jessell建立。¹.

方案

一、示意图概述：

本视频展示了鸡胚整体免疫组织化学染色的各个步骤。首先，用PFA固定胚胎 [IHC1]；然后淬灭内源性过氧化物酶活性 [IHC2]；接着将胚胎与一抗孵育 [IHC3]；经过多次洗涤后，再与二抗孵育 [IHC4]；使用DAB显色 [IHC5]，抗体染色呈橙色 [IHC6]。

第1部分：胚胎固定

1. 对鸡胚进行整体免疫组织化学染色时，首先用镊子轻敲蛋壳并移除部分蛋壳以打开鸡蛋。
2. 用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。
3. 使用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
4. 在解剖显微镜下，小心去除胚胎周围的膜和残留卵黄，并将胚胎转移至另一含有新鲜PBS的培养皿中。
5. 用镊子和昆虫针固定胚胎，吸除PBS，加入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，在室温下固定1小时。

第二部分：抗体步骤前胚胎的准备

1. 为尽量减少潜在的微生物污染，后续所有步骤均应使用ddH₂O。
2. 胚胎固定后，吸除固定液，并作为化学废弃物妥善处理。用PBS填充培养皿。
3. 接着，使用显微解剖刀在胚胎周围切出一个方形切口，以去除胚外膜。用镊子移除昆虫针。
4. 移除针后，使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有PBT（PBS pH 7.4，0.5% Triton X）的闪烁瓶中。
5. 用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗3次。
6. 从闪烁瓶中移除PBT，并替换为含有0.3% H₂O₂的PBTx，以灭活潜在的内源性过氧化物酶。
7. 在旋转摇床上室温孵育2小时。
8. 用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共3次；随后每次30分钟，共3次。

第3部分：抗体孵育

1. 为用抗体对胚胎进行染色，首先将胚胎在封闭缓冲液或含1% BSA、1% NGS和PBT的溶液中洗涤1小时（我们使用NGS，因为二抗由山羊产生）。在室温下于摇床上孵育1小时。
2. 用封闭缓冲液将一抗按1:1比例稀释，并将胚胎在此溶液中于4°C在摇床上孵育2天。一抗的稀释倍数取决于所选一抗的种类。此处我们使用来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）的抗体，该抗体以培养上清形式提供，我们用封闭缓冲液将其按1:1稀释。
3. 接下来，在PBT中进行3次、每次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行3次、每次1小时的洗涤。
4. 洗涤后，用封闭缓冲液将二抗按1:2500比例稀释（本实验中使用的是辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）），并将胚胎在4°C于摇床上在此溶液中过夜孵育。
5. 在PBT中进行3次、每次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行3次、每次1小时的洗涤。

第3部分：显色反应

1. 为了显色染色后的胚胎，首先用 Tris 缓冲液（100 mM Tris HCl，pH 7.4）进行两次、每次 20 分钟的洗涤。
2. 同时，在通风橱中将 DAB 底物（3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐）溶解于 Tris 缓冲液中，终浓度为 500 μg/mL；将溶液置于冰上并避光保存。
3. 移除含有胚胎的小瓶中的最后一次 Tris 缓冲液洗涤液，替换为步骤 3.2 中配制的 5 mL DAB 溶液。在避光条件下，于旋转混合仪上孵育 20 分钟。将使用过的 Eppendorf 吸头弃入含有 10% 次氯酸钠溶液的容器中，以对 DAB 进行去污染处理。
4. 同时，在冰上配制 0.3% 的 H₂O₂ 储存液（溶于 dH₂O）。
5. 向含有胚胎和 DAB 溶液的小瓶中加入 50 μL H₂O₂ 储存液。保持避光。1–2 分钟后，在显微镜下观察反应进程。

第4部分：胚胎样本的摄影与组织学处理

1. 当显色反应完成后，将DAB溶液倒入含漂白剂的废液桶中处理，并加入5 ml自来水替代。
2. 用PBS洗涤两次，每次10分钟。
3. 如需进行拍照及石蜡切片，依次使用25%、50%、75%和100%乙醇进行脱水处理，每级乙醇中各浸泡10分钟。
4. 用0.5–1 ml雪松油替代乙醇（此步骤可使胚胎透明化），随后在雪松油中进行拍照处理。
5. 拍照完成后，将胚胎放回样品管中，用100%乙醇替换雪松油，并重复一次乙醇置换步骤。
6. 用含100%乙醇的5%快绿FCF染色液替换乙醇，孵育3分钟（此步骤可使胚胎在组织学观察中清晰可见）；随后用100%乙醇替换快绿FCF染色液，并进行组织学后续处理。

代表性结果：

在下图所示的示例中，胚胎分别在HH 10期（A）、12期（B）和11期（C）进行解剖；胚胎在正在形成的神经嵴、体节以及神经管中均显示出PAX7的表达（A，B）；在（C）中，脊索使用15.3B9（Not-1）进行标记（抗体由发育研究杂交瘤库提供）。

讨论

本视频展示了在小鸡胚胎中进行整体免疫染色的各个步骤。该方案主要用于在小鸡中对新型抗体进行时空特异性表征^2,3，以及利用已知抗原标记物来确定损伤后引起的胚胎畸形⁴。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鸡蛋		Charles River Laboratories	优质受精卵	已受精，HH4期（16小时）
体视显微镜	显微镜	Leica Microsystems	MZ9.5 或类似型号
Marsh自动孵育箱	其他	Lyon	RX
弯头镊子（1）	工具	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
直头镊子（2）	工具	Fine Science Tools	11002-13
精细剪刀	工具	Fine Science Tools	14161-10
塑料培养皿	工具	Falcon BD	353001
橡胶吸头	工具	Electron Microscopy Sciences	70980
巴斯德毛细移液管	工具	Electron Microscopy Sciences	70950-12	在火焰下将边缘烧圆
显微解剖刀	工具	Fine Science Tools	10056-12	用于固定后从周围膜结构中切下胚胎
Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础液	试剂	Dow Corning	0001986475	按1份固化剂与9份基础液混合；在37°C下过夜固化
16% PFA	试剂	Electron Microscopy Sciences	15710
30% H2O2	试剂	Sigma-Aldrich	H1009
BSA	试剂	Sigma-Aldrich	A3803
NGS	试剂	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
一抗	试剂	发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）	4G11, 15.3B9, PAX7	针对这些抗体，研究人员使用了小鼠供体
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）	试剂	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
3,3’-四盐酸联苯胺（diaminobenzidine tetrahydrochloride）	试剂	Pierce, Thermo Scientific	34001	于-20°C保存；使用前将瓶恢复至室温
雪松油	试剂	Sigma-Aldrich	W522503
快绿FCF	试剂	Sigma-Aldrich	F7252
直径0.2 mm的昆虫针		Fine Science Tools	26002-20