从美洲鲎（Limulus polyphemus）采集血液

摘要

美洲鲎（Limulus polyphemus）可以说是获取大量无脊椎动物血液最方便的来源。其血液成分简单，循环系统中仅含一种细胞类型——颗粒性变形细胞，血浆中也仅有三种丰富的蛋白质：血蓝蛋白、C反应蛋白和α2-巨球蛋白。血液通过心脏采集，再经离心分离出血细胞和血浆。

摘要

鲎是所有长寿无脊椎动物中免疫系统研究最为清楚的物种。由于能够方便地采集大量血液，且其血液成分简单，使得对鲎免疫系统的研究得以顺利开展。鲎在循环系统中仅含有一种细胞类型，即颗粒性变形细胞。其血浆的盐浓度与海水相当，且只含有三种丰度较高的蛋白质：血蓝蛋白（呼吸蛋白）、C反应蛋白（在包括细菌细胞在内的外来细胞的细胞溶解性破坏中发挥作用）以及α2-巨球蛋白（可抑制入侵病原体的蛋白酶）。血液通过直接心脏穿刺法采集，操作需在尽可能减少脂多糖（即内毒素，LPS）污染的条件下进行，LPS为革兰氏阴性菌的代谢产物。一只大型个体可采集200–400 mL血液。若需研究血浆，应立即通过离心去除血细胞，随后可将血浆分离为不同的蛋白质组分。为便于显微镜下研究血细胞，可将少量血液收集至无LPS的等渗盐水（0.5 M NaCl）中，并在培养皿表面放置一张或多张无LPS的盖玻片，使细胞直接贴附于其上，随后将这些盖玻片转移至简单的观察室中进行显微观察。另一种用于直接观察的制备方法是将3–5 mL血液收集至无LPS的胚胎培养皿中，然后将聚集的变形细胞碎片移植至一个由载玻片和盖玻片夹合形成的观察室中。在此体系中，运动性的变形细胞会迁移至盖玻片表面，便于直接观察。血液凝固系统涉及变形细胞的聚集以及一种称为凝固蛋白（coagulin）的蛋白质在细胞外形成凝块，该蛋白由血细胞的分泌颗粒释放。对洗涤后血细胞进行生化分析时，必须避免细胞发生聚集和脱颗粒现象，这可通过将血液收集至含0.1倍体积的2% Tween-20和0.5 M无LPS NaCl溶液中实现，随后离心收集细胞，并用0.5 M NaCl溶液洗涤。

方案

与采血相关的鲎解剖特征（图1）

图1

1. 从身体前部到后部，主要分为三个部分：头胸部（P）、腹部（O）和尾节（T）¹。
2. 头胸部的前缘和侧缘自由边缘称为缘板。
3. 腹部最后端的凹陷处，即尾节与之连接的部位，称为末端湾。
4. 头胸部与腹部连接的关节称为铰合部（H）。
5. 心脏位于背侧中线上，紧贴头胸部和腹部背甲的下方²（图2）。
   
   
   
   
   图2
   
   

一般注意事项、无菌操作及避免脂多糖（内毒素）暴露的防护措施

1. 影响采血成功的主要因素是细胞聚集、胞吐作用以及凝固素凝块的形成。脂多糖（又称内毒素，LPS）是革兰氏阴性细菌的产物，可刺激细胞发生聚集和胞吐作用。对于洗涤后的细胞，引发胞吐的LPS阈值浓度为0.1–1 mg/mL，但在血浆中悬浮的细胞可被显著更低的浓度所激活³。内毒素不能通过简单的高压灭菌灭活，因此可认为其存在于未经认证为无内毒素的表面、溶液和试剂中。
2. 为降低采血过程中发生凝固的风险，应仅选择健康、无损伤的个体动物进行采血。采血前将动物在4°C环境中预冷1–2小时。操作过程中需遵循无菌技术，避免内毒素污染。
3. 无内毒素的3%生理盐水在临床医学中已有应用，可从医疗供应商处购买（参见专用试剂与耗材表）。玻璃器皿和金属器械可通过180°C孵育4小时去除LPS。无菌一次性注射器针头、培养皿式培养皿以及带螺帽的离心管均为无内毒素产品，只要遵循正确的无菌操作技术，可直接使用而无需额外处理。
4. 不同动物血液细胞的稳定性存在差异，某些个体的血细胞即使在极为谨慎的采血条件下也会发生自发性脱颗粒，导致凝固素凝块的形成。而其他个体的鲎血细胞则明显更为稳定，在遵循适当操作流程的情况下，采血及血细胞与血浆分离过程中可保持完整的颗粒状态。
5. 已有多种试剂被报道可在采血后稳定血细胞，包括咖啡因（将血液采集至含10 mM咖啡因的无内毒素3% NaCl溶液中，体积为血液的0.25倍）⁴、普萘洛尔（终浓度1 mM）⁵、二甲基亚砜⁶、二价阳离子螯合剂（将血液采集至等体积的含0.1 M葡萄糖、0.03 M柠檬酸钠、0.026 M柠檬酸、10 mM乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA）、pH 4.6的溶液中）⁷、G蛋白和磷脂酶C通路抑制剂（霍乱毒素、百日咳毒素、U73122）⁸、以异乙磺酸根替代氯离子⁹、氯离子通道阻断剂⁹、环磷酸腺苷（cAMP）拮抗剂⁹、巯基试剂（5 mM N-乙基马来酰亚胺，NEM）⁵，以及具有膜活性的去垢剂Tween-20（将血液采集至含2% Tween-20的无内毒素0.5 M NaCl溶液中，体积为血液的0.1倍）。

采集鲎血的耗材与试剂：大量血液的采集

1. 一只或多个大型、无损伤的鲎
2. 装有70%乙醇的喷瓶
3. 吸水纸（Kimwipes）
4. 14号针头
5. 坚固的镊子
6. 装有冰块的冰桶
7. 50 mL螺口塑料一次性离心管
8. 用于放置50 mL离心管的管架
9. 台式离心机
10. 无菌50 mL血清移液管
11. 球型移液器吸头
12. 一次性无菌过滤装置
13. 真空泵
14. 无脂多糖（LPS-free）3% NaCl溶液（用于采集血细胞）
15. Tween-20（用于采集血细胞）

大容量出血的准备工作

1. 采血时应选用体型较大且无损伤的动物。采血前将动物置于冷藏室中冷却1小时。
2. 准备一个舒适的操作环境，设置一个高度约为0.3米的稳定支架，用于放置冰桶（邮寄冷藏或冷冻试剂所用的一次性聚苯乙烯泡沫塑料运输箱较为合适），并为操作者配备一个低矮的座椅。将冰桶置于支架上，座椅紧靠该装置。操作者应能舒适地长时间坐着，双肘 resting on thighs，左手握住一只正在挣扎的鲎，并将其置于冰桶中直立放置的采血管上方。
3. 将4至6个50 mL带螺旋盖的一次性塑料离心管预先在冰浴中预冷。将这些离心管直立放置于冰浴容器边缘周围的冰中。在开始采血操作前，取下管盖并将其放置在旁边的桌面上，操作过程中需遵循无菌技术。
4. 取下14号针头的保护帽，用坚固的镊子轻轻松动针头套管内的针头，但不要将针头从套管中取出。保持无菌状态。切勿用手接触针头的任何部分。将带针头的套管放置在邻近的操作台面上，确保针头暴露的尾部不与任何表面接触，以维持其无菌性。
5. 用70%乙醇润湿一张Kimwipe纸巾。

动物放血（专为右手操作者设计）

1. 采血时固定动物：用左手握住动物，四指接触头胸部前缘，拇指抓住尾部基部的腹面末端区域（尾节湾）。动物的腹面朝向手掌，尾节沿拇指根部延伸并越过手腕。轻轻弯曲动物，使头胸部与腹部成直角（图3a）。
   
   
   
   图3
   
   
2. 用蘸有70%乙醇的Kimwipe擦拭头胸部与腹部之间暴露的铰链关节（图3b）。
3. 旋转左手，使第二至第四指位于上方，动物背面向上。右手持14号注射器针头（仍处于保护套内），将其插入左手中指与无名指之间。用右手持镊子夹住针柄，取下针头的保护套（图3c）。旋转左手，使手背朝向左侧，拇指和食指朝上，动物呈倒置状态，背面向着右手。将针柄置于50 mL收集管口上方，调整动物位置，使针尖对准铰链关节，针杆与背中线平行（图3d）。将针尖穿过铰链关节插入心脏管腔，保持针杆与背中线平行，并沿中线插入，针柄仍位于收集管管口上方。针头插入深度约为1–2 cm，进入头胸部的心脏部分。一旦刺破心脏，血液将迅速流出（图4a，箭头所示），因此必须确保注射器针头的输出端位于收集管管口上方，以收集初始的血流冲击。
4. 血液最初以连续流的形式流出，当采集量达到约30–50 mL后，流速会减慢为逐滴流出（图4b）。为改善血流，可轻微调整针尖方向：上下或左右倾斜针头，或将针尖更深地插入心脏，或将其拉近铰链关节，以找到最佳血流位置。切勿过度压迫动物，以免损伤动物，并防止外渗血液引发凝血。
   
   
   
   图4
   
   
5. 每当一支收集管充满血液后，旋转冰浴装置，使下一支空管移至针头输出端下方。
6. 当出血减慢时，存在空气逆向流入针头并进入心脏的风险。这种情况可能发生在动物伸直时，导致血压下降。应通过保持动物弯曲状态，或仅缓慢允许其伸直，来防止此类情况发生。
7. 当动物停止出血后，将采血针从心脏中取出。立即盖紧收集管，并在台式离心机中以1000 RPM离心5分钟。血细胞将在收集管底部形成紧密的沉淀。由于所有凝血成分均存在于血细胞的分泌囊泡内，一旦血浆与细胞分离，血浆凝固的风险即被消除。
8. 必须避免外渗血液发生凝固。以下措施可降低凝血风险：预先冷却动物并将收集管置于冰浴中；轻柔操作动物；减缓血液从针头流出的速度；采血后立即离心；避免针头和收集管被内毒素污染；保持无菌操作。如前所述，某些个体动物的血细胞特别敏感，即使采取上述预防措施，仍可能启动胞吐作用。
9. 离心后，检查各管是否有血液凝固迹象——细胞丝状物或凝胶状凝块附着于管壁，凝块顶部出现凝胶状物质，或更严重的情况：液柱中存在大量凝块并包裹血细胞（图4c，箭头所示）。这些管中的液体为血清而非血浆，含有血细胞分泌的产物。
10. 使用50 mL无菌移液管将血浆转移至无菌管中。移液时需小心，避免吸入管底细胞沉淀中的任何细胞。最好在沉淀上方保留几毫升血浆，以避免扰动细胞沉淀。
11. 上述操作旨在收集大量未受血细胞分泌产物污染的血浆。若需收集大量洗涤后的血细胞，应将血液收集至含0.1倍体积的2% Tween-20溶于3%无LPS NaCl溶液的容器中。轻柔离心10分钟以形成疏松的细胞沉淀，随后用多次更换的无LPS 3% NaCl溶液洗涤细胞。通过将洗涤后的细胞在无LPS蒸馏水中裂解，可制备含有血细胞分泌产物的提取物。该裂解物包含多种参与抗微生物免疫防御的蛋白质和多肽^10,11，还含有凝固原（coagulogen）——即细胞外血凝块结构蛋白的酶原形式，以及一系列将凝固原转化为凝固素（coagulin）的蛋白酶。凝固素是可聚合形成凝块纤维的蛋白形式¹²。该提取物类似于 commercially available 产品——美洲鲎变形细胞裂解物（Limulus amebocyte lysate, LAL），用于检测脂多糖（LPS）的存在¹³。将凝固原通过蛋白水解修饰为凝固素的蛋白酶级联反应可被LPS激活¹⁴。
12. 采血后动物的处理。采用上述方法采血，动物耐受性良好。在伍兹霍尔海洋生物实验室工作时，我通常在采血后将动物放归海洋，预期其能够存活。若动物饲养于远离鲎自然分布区的水族箱中，可每月采血一至两次。如下文所述，圈养动物需高质量的水质和频繁喂食以维持健康。可通过破坏位于两眼之间背中线处的背神经节实施安乐死。

血浆的处理与储存

1. 蛋白酶防护。如果血浆将用于蛋白质纯化，则应在采集后立即加入蛋白酶抑制剂进行处理。加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度达到 1 mM。PMSF 通常以 0.1 M 的储存液形式保存于 DMSO 或乙醇中。PMSF 在水中极不稳定¹⁵，因此不能依赖其提供长期保护作用，但在血浆与血细胞分离后立即添加，可灭活可能已从细胞中释放出的少量蛋白酶。
2. 无菌过滤：使用带有 0.22 mm 孔径滤膜的一次性中等容量滤器，在负压条件下通过超滤法对血浆进行灭菌。此类滤膜容易堵塞，因此建议在过滤前先对血浆进行离心，以减轻该问题。若处理大量血浆，建议先用孔径为 1 mm 的 Millipore 滤器进行预过滤，再用孔径为 0.45 mm 的 Millipore 滤器过滤。
3. 血浆可通过添加 NaN₃ 至终浓度 0.2 mg/mL 或通过无菌过滤来防止细菌污染。未经无菌处理的血浆，若未采取上述任一种抗菌措施，绝不可储存超过 2 天。
4. 血液凝固。与哺乳动物的凝血系统不同，鲎（Limulus）血浆中不含任何血液凝固所需的成分。相反，整个凝块形成的机制，包括凝块的结构蛋白（凝固原，coagulogen）以及将凝固原加工为可聚合形成不溶性凝块的蛋白酶系统，均存在于血细胞的分泌颗粒中¹⁶。因此，若在血细胞尚未发生胞吐作用之前即将其去除，则血浆中完全不含凝血相关蛋白，可无限期保持液态。
5. 蛋白质纯化。血蓝蛋白在血浆中的浓度为 40 mg/mL，由 48 个 70 kDa 亚基组成。可通过超速离心（40,000 × g，8 小时）或使用大孔径排阻树脂（如 BioGel A5m）进行凝胶过滤来分离该蛋白¹⁷。C-反应蛋白在血浆中的浓度为 1–5 mg/mL，可通过磷酸乙醇胺-Sepharose 亲和层析进行分离，并用钙螯合剂洗脱¹⁸。广谱蛋白酶抑制剂 α₂-巨球蛋白，则可在去除血蓝蛋白和 C-反应蛋白后，通过 Sephacryl S-300 树脂进行凝胶过滤纯化¹⁹。

培养物中运动性血细胞的显微镜检查

1. 阿米巴细胞菌苔的建立 体外：将无内毒素的3% NaCl溶液加入无菌塑料培养皿（35 mm培养皿加1 mL，60 mm培养皿加2.5 mL，90 mm培养皿加6 mL）。通过心脏穿刺采集血液，方法如上所述，但改为使用23号、1英寸无菌注射器针头代替14号针头。血液自23号针头逐滴流出，分别收集1滴入35 mm培养皿，3滴入60 mm培养皿，9滴入100 mm培养皿。随后轻轻旋转培养皿，先做环形晃动，再做前后晃动，使血细胞在3% NaCl溶液中均匀混悬。室温孵育5分钟，使血细胞贴附于培养皿表面，然后吸除初始的生理盐水，更换为所需缓冲液³.
2. 若希望维持基质附着血细胞处于未脱颗粒状态，应将初始的生理盐水-血浆混合物替换为新鲜的无LPS 3% NaCl溶液。即使在无LPS存在的情况下，血浆也会加速血细胞的自发脱颗粒，去除血浆可稳定血细胞的未脱颗粒状态。
3. 如果初始的生理盐水被无菌血浆取代，血细胞便会从循环血液细胞的卵圆形形态（图5）转变为扁平状并贴附于基质表面，随后开始脱颗粒，并在铺展的变形细胞层上方形成一层由凝胶原蛋白构成的细胞外血凝块 ²⁰.
   
   
   
   图5
   
   
4. 建立聚集型变形细胞的外植体培养。在无菌且无脂多糖（LPS）条件下采集血液时，血细胞会从悬浮状态沉降并聚集成类似组织的团块。一种便于使用的容器是玻璃胚胎培养皿，将其在180 °C下孵育4小时以去除LPS。⁰C. 使用19号针头经心脏穿刺采集的血液置于该容器中，在室温下孵育1 - 2小时，随后用无菌的18号注射器针头从变形细胞聚集体中切取1 mm²的小块，夹于两片盖玻片之间，或夹在一片盖玻片与载玻片之间，其间以盖玻片碎片作为间隔物。约半小时后，变形细胞开始从组织块边缘迁移至盖玻片表面（图6a），可在相差显微镜或微分干涉相差（DIC）光学系统下观察。 ²¹最初，迁移的细胞较为致密，具有透明的伪足（图6b（m）），这些伪足先伸展至迁移基质上方，随后降低并与表面接触，前向运动则通过颗粒状胞质流入伪足而实现。 ²²随后，细胞变扁平（图6b (f)），并开始脱颗粒（图6b (d)），同时停止运动。 ²³. 此处所述的培养腔室可将不同的实验试剂灌注至腔室内，以研究这些试剂对细胞运动性及颗粒外排作用的影响 ⁹有关用于显微镜检查的变形细胞培养的扩展方法学综述，可参见 ²⁴.
   
   
   
   图6
   
   

成年鲎在水族箱中的饲养维护

鲎需要高质量的海水，可饲养在配备水净化系统的水族箱中，该系统需提供颗粒过滤、充氧以及水体脱硝功能²⁵。动物应每周喂食2至3次，食物可选择虾、龙虾、鱼或鱿鱼。喂食时需将动物从水族箱中取出，翻转至背部朝下，将食物放置于口部。若动物饥饿，会很快开始吞咽食物。根据海水系统的复杂程度，应在单独的海水容器中继续维持动物约一小时，直至其排便；或在开始进食后即可将其放回水族箱。长期饲养时，应将动物置于避光环境中，以防止头胸甲表面生长绿藻或蓝绿藻。藻类会侵蚀头胸甲，而由于成年个体不再蜕皮，这种侵蚀将导致动物死亡²⁶。在自然环境中，这些动物大部分时间部分埋于沙中，但在水族箱中使用沙子或砾石会增加维持长期清洁所需难度。

讨论

鲎有四个物种，其中 Limulus polyphemus 分布于北美东海岸，另外三个物种的分布范围从日本延伸至孟加拉湾。由于在距今4.45亿年前的化石中已发现解剖结构相似的形态，该动物被称为“活化石”²⁷。鲎是一种寿命较长的动物，需要10至13年才能达到性成熟，寿命至少可达20年²⁸。尽管因其被广泛用作鳗鱼和螺类渔业的诱饵而遭受大量捕捞²⁹，美洲鲎目前仍相对丰富，允许非致死性采集血液，从小型成体可采集50 mL，从大型雌性个体最多可采集400 mL。即使采集如此大量的血液，整个过程也可在10分钟内完成。据我所知，尚无其他容易获得的无脊椎动物能以如此小的付出提供如此多的血液。

鲎变形细胞溶解物（LAL）试验对内毒素的检测具有重要意义，内毒素是革兰氏阴性菌存在的指示物，这促使人们关注鲎的免疫系统¹³。LAL试验依赖于脂多糖（LPS）激活血液凝固系统的起始蛋白酶，通过观察凝块形成或蛋白酶活性的比色测定来读取结果¹⁴。在免疫系统研究中，最受关注的两个部分是血浆中...