本文介绍了一种从出生后小鼠中分离并培养小脑颗粒神经元前体细胞及小脑颗粒神经元的方法。
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本文内容
摘要
摘要
小脑皮层是一个结构特征明确的脑区，为研究神经元特性及其发育过程提供了独特的机会1,2。在小脑的各类神经元（颗粒细胞、浦肯野细胞和抑制性中间神经元）中，颗粒神经元数量最多，是哺乳动物大脑中最丰富的神经元类型。在啮齿类动物中，小脑颗粒神经元由小脑皮层最外层——外颗粒层（EGL）中的前体细胞在出生后前两周内生成。本文所述方案介绍了从小鼠出生后小脑组织中富集并培养颗粒神经元及其前体细胞的技术。我们将描述一系列纯度逐步提高的培养方法3,4，可用于研究增殖性前体细胞向颗粒神经元的分化过程5,6。当前体细胞完成分化后，这些培养物还可提供均一的颗粒神经元群体，用于实验操作及对突触形成、谷氨酸受体功能7、与其他纯化的小脑细胞的相互作用8,9或细胞死亡7等现象进行表征研究。
方案
第1部分：准备工作（解剖前1-2天）（视频中未展示）
- 准备培养液和培养基：
- 4X CMF-PBS-EDTA（用于Percoll稀释的无钙镁磷酸盐缓冲液-EDTA）：每升加入32 g NaCl、1.2 g KCl、8 g葡萄糖、2 g NaH2PO4、1 g KH2PO4、8 ml 2% NaHCO3储备液、10 ml 1M EDTA（pH 8.0）至去离子/蒸馏水中。定容至1升，并调节pH至7.4。过滤除菌。
- HBSS-葡萄糖：向无钙镁的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中加入葡萄糖（6克/升），过滤除菌。500 ml可于4°C保存最多一个月。
- 培养基：无血清培养基（SFM）和含10% FBS的培养基。向48 ml Neurobasal A培养基中加入500 μl 100X GlutaMAX I、500 μl 100X青霉素-链霉素（终浓度为100单位青霉素和100 μg链霉素）、6.25 μl 2 M KCl（终浓度250 μM）。将混合液分为两份，分别为9 ml和40 ml。制备含10% FBS的培养基时，向9 ml分装液中加入1 ml热灭活FBS。制备SFM时，向40 ml分装液中加入800 μl无血清添加剂B-27。过滤除菌后于4°C保存，最多保存2周。为获得最佳效果，建议每次实验前新鲜配制培养基。
- 制备Percoll梯度液：
- Percoll以液体形式提供，使用前必须酸化。制备储备液时，在1–2小时内逐滴加入1N HCl至Percoll溶液中，直至pH达到7.4。加入HCl过快会导致Percoll聚集。每升Percoll约需6.5 ml 1N HCl。过滤除菌后于4°C保存。
- 在Percoll梯度步骤中将使用35%和60%（体积比）的Percoll稀释液。配制100 ml Percoll稀释液，分别含35 ml或60 ml Percoll储备液、25 ml 4X CMF-PBS-EDTA，并用去离子/蒸馏水定容至终体积。向60%溶液中加入几滴甲苯胺蓝；有助于观察界面和细胞层。过滤除菌后于4°C保存。
- 4X CMF-PBS-EDTA使用时间不应超过3个月，否则缓冲能力不足会导致操作过程中细胞死亡增加。
- 制备盖玻片：玻璃盖玻片（最好来自Carolina Biological Supply Company）用10% HCl在室温下轻度振荡清洗过夜，用去离子/蒸馏水充分冲洗后，保存于70%乙醇中。使用前，用镊子夹住单个盖玻片在明火（本生灯）上短暂灼烧，直至乙醇完全蒸发，实现火焰灭菌。12 mm玻璃盖玻片可置于4孔培养板中，25 mm盖玻片可置于6孔培养板中。
- 用基质包被培养容器：若需进行免疫荧光染色或药物处理，使用玻璃盖玻片更为合适，因其可方便地封片于载玻片上，便于显微镜下观察。当需要大量细胞用于提取蛋白或RNA样本时，可将细胞培养于塑料培养皿中。解剖前一晚，需将用于培养的玻璃盖玻片或塑料培养皿用聚-D-赖氨酸包被（500 μg/ml；6孔板每孔800 μl，4孔板每孔350 μl）。聚-D-赖氨酸储备液浓度为5 mg/ml，保存于-20°C，使用前用无菌去离子/蒸馏水稀释并过滤除菌。培养容器于37°C孵育过夜（或接种前至少2小时），接种前用无菌去离子/蒸馏水洗涤两次。
- 制备预接种培养皿：这些培养皿用于在正式培养前对分离的小脑细胞进行预接种，以去除胶质细胞污染物，因为胶质细胞更容易黏附于低浓度基质表面。用4 ml/皿的聚-D-赖氨酸（100 μg/ml；注意此浓度为培养所用浓度的1/5）包被两个60 mm塑料培养皿。37°C孵育过夜（或解剖前至少2小时）。解剖前立即移除聚-D-赖氨酸溶液，用无菌水洗涤两次，并在超净台中晾干。
- 将解剖工具在高压灭菌器中灭菌，或在解剖当天将工具浸入70%乙醇中20分钟。所需工具包括：Permaset剪刀、显微解剖剪、四把Dumont #5解剖镊。
第二部分：解剖前准备（解剖当天）——（视频中演示）
以下所有操作均须在组织培养罩内进行，除非另有说明。
- 用70%乙醇擦拭解剖区域。将培养基在水浴或5% CO2、37°C培养箱中预热至37°C。
- 首次使用新的木瓜蛋白酶解离系统试剂盒（Worthington）时，配制白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液。向白蛋白-卵黏蛋白抑制剂混合物中加入32 ml EBSS（Earle's平衡盐溶液；试剂盒中提供），在准备其他组分时使其充分溶解。首次使用时进行重悬，之后将剩余溶液储存于2–8°C，直至该试剂盒允许的五次分离操作全部完成为止。
- 向解离试剂盒中的一个木瓜蛋白酶小瓶中加入5 ml EBSS（每瓶足以解离5只出生后第5天小鼠的小脑）。将木瓜蛋白酶小瓶置于5% CO2、37°C培养箱或37°C水浴中孵育5至10分钟，直至木瓜蛋白酶完全溶解且溶液呈透明状。解剖过程中保持该溶液于室温。
- 向解离试剂盒中的一个DNase小瓶中加入500 μl EBSS。轻轻敲击小瓶进行混匀，避免剪切力导致DNase变性。取250 μl该溶液加入含木瓜蛋白酶的小瓶中（终浓度为20单位/ml木瓜蛋白酶和0.005% DNase）。剩余的DNase溶液保留，用于步骤5.1或6.1。
第3部分：解剖与脑膜去除
- C57BL/6J小鼠颗粒细胞培养的最佳时间为出生后第4至6天，此时外颗粒层中颗粒细胞前体细胞的数量达到峰值1,10。每次仅解剖一只幼鼠，随着对小脑解剖操作的熟练，应尽量将每只幼鼠的解剖时间缩短至不超过6分钟。操作速度至关重要。
若省略Percoll梯度离心步骤，8只出生第5天的小鼠幼崽可获得足够接种1块6孔培养板（或6个25 mm盖玻片）的细胞，或足够接种6块4孔培养板（或24个12 mm盖玻片）的细胞。每只幼崽的细胞得率约为4×10⁶至5×10⁶个，接种密度范围为1×10⁵至5×10⁵个细胞/cm²。由于在Percoll梯度离心步骤中约有15–20%的细胞损失4，因此若需达到相同的细胞接种密度，则需使用更多动物。 - 将15 ml HBSS-葡萄糖用移液器移入一个60 mm塑料组织培养皿中，10 ml移入无菌Falcon 15 ml锥形塑料管中。置于冰上。
- 在超净台外，用70%乙醇擦拭幼鼠头部。使用Permaset剪刀将幼鼠断头。（视频中将不展示断头过程。）
- 在通风橱内，用杜蒙镊子夹住头部，使颅骨后方可清晰可见。将显微解剖剪插入枕骨大孔，沿直线向眼部方向剪开，以暴露脑组织。用镊子剥离皮肤，并掀开颅骨以暴露大脑。用杜蒙镊子夹住小脑及其周围中脑组织，将其剪下并转移至含有HBSS-葡萄糖的培养皿中。（若小脑仍与周围组织相连，则更易于操作并去除脑膜。）
- 在解剖显微镜下，用一把精细的Dumont #5镊子轻轻剥离小脑表面及小脑叶间的脑膜，同时用另一把镊子将小脑固定在培养皿上。你会观察到小脑表面存在血管，这些血管有助于识别脑膜的位置。继续去除脑膜，直至小脑呈现均匀的白色毛绒状外观。将小脑从其余中脑组织上分离下来，翻转至腹面，去除位于腹侧小脑与相邻中脑之间的红色丝带状结构——脉络丛。每解剖出一个小脑后，立即放入盛有冰冷HBSS-葡萄糖溶液的15 ml锥形管中，并置于冰上。每解剖3个脑组织后，更换一次新的HBSS-葡萄糖溶液。
第4部分：细胞悬液
- 所有解剖步骤完成后，从离心管中移除 HBSS-葡萄糖溶液，并替换为步骤 2.4 中配制的木瓜蛋白酶溶液。尽管试剂盒建议将组织切成小块，但我们发现，在此年龄段无需对小脑组织进行切割或切碎。将组织与木瓜蛋白酶溶液（置于 15 ml 锥形管中）放入 37°C 水浴或含 5% CO2 的 37°C 培养箱中孵育 15 至 20 分钟。对于 4 至 8 个小脑样本，37°C 下孵育 15 分钟已足够；若样本数量较多，则建议孵育 20 至 30 分钟。每 3 至 4 分钟轻轻振荡离心管一次。
- 使用经 FBS 涂层处理的无菌 p1000 气溶胶吸头对混合液进行吹打。此步骤应轻柔操作，避免产生气泡。也可使用火焰抛光的玻璃移液管，但我们发现经血清涂层处理的无菌 p1000 气溶胶吸头效果同样良好。为使吸头完成 FBS 涂层，使用前将 FBS 吸取上下移动两次即可。吹打约 10 次即可充分解离组织，溶液将变得浑浊。将细胞悬液静置 30 至 60 秒，使未完全解离的大块组织沉降至管底。
- 使用经血清涂层处理的吸头，小心吸取上层悬浮细胞（避免吸出管底未解离的组织碎片），转移至新的 15 ml 锥形离心管中。在室温下以约 200×g 离心 5 分钟。同时准备重悬液：在无菌离心管中，将 2.7 ml EBSS 与 300 μl 重组的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液混合，再加入 150 μl 步骤 2.4 中的 DNase 溶液。
- 离心后，弃去上清液，并立即使用经血清涂层处理的 p1000 气溶胶吸头，将细胞沉淀重悬于步骤 4.3 中配制的稀释 DNase/白蛋白抑制剂溶液中。
- 按以下方法制备不连续密度梯度：向一个 15 ml 锥形离心管中加入 5 ml 白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液，小心地将细胞悬液铺加在其上方。在室温下以约 70×g 离心 6 分钟。解离后的细胞将形成沉淀聚集于管底，而膜碎片则停留在界面处。
- 若希望获得富集颗粒细胞的培养物，可跳过 Percoll 梯度分离步骤（该步骤可获得更纯的小脑颗粒细胞培养物），直接进入第 6 部分。若希望进一步通过 Percoll 梯度分离法从胶质细胞和大中间神经元中分离颗粒细胞，则进入第 5 部分。使用 Percoll 梯度步骤将降低细胞得率。在我们的实验中，细胞得率降低约 20–35%。然而，颗粒神经元及前体细胞的富集度可从约 90% 提高至 95–99%。
第5部分：Percoll梯度分离
- 弃去上清液，并立即用 2 ml 含步骤 2.4 中 50 μl DNase 的 HBSS-葡萄糖溶液重悬沉淀。通过重力作用将细胞悬液过滤至尼龙网筛（孔径 70 μm）中。此步骤可去除较大的非神经元细胞，从而获得更佳的单细胞悬液。
- 准备两根火焰抛光的玻璃巴斯德吸管。操作方法为：轻轻用火焰灼烧玻璃吸管尖端，直至边缘光滑，且管腔直径缩小至原始尺寸的 40–50%。注意避免开口过小。
- 制备 Percoll 梯度液。将 10 ml 35% Percoll 溶液加入一个 50 ml 无菌锥形管中。将 60% Percoll 溶液（10 ml）吸入一支 10 ml 无菌注射器，并连接无菌脊髓穿刺针。用该针将 60% Percoll 溶液缓慢注入 35% 溶液下方，即沿管底注入，形成下层。注意保持两层之间界面清晰。使用火焰抛光的吸管将细胞悬液沿管壁缓慢加至梯度液上层，避免扰动界面。
- 小心将离心管放入离心机，以 1800×g 离心。每 20 秒增加一档转速（转速递增顺序约为：18、70、200、440、850、1100、1800×g），使加速过程约持续 2 分钟达到目标转速。当转速达到 1800×g 时开始计时，离心 10 分钟。离心结束后，再每 20 秒降低一档转速，逐步减速。
- 移除梯度液上层界面部分（含有大胶质细胞、浦肯野细胞和中间神经元），弃去。
- 用火焰抛光的吸管小心吸取 35% 与 60% Percoll 液层之间的细胞界面部分，转移至一个 50 ml 锥形管中。加入 3 倍体积的 HBSS-葡萄糖溶液，通过反复倒置混匀。在 1100×g 条件下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，加入 4 ml 含 10% FBS 的培养基和 50 μl DNase。用火焰抛光的吸管轻柔重悬沉淀，形成单细胞悬液。继续进行步骤 6.2。
第6部分：预铺板与铺板
- 弃去上清液，并立即用4 ml含50 μl DNase（来自步骤2.4）的10% FBS培养基重悬沉淀。通过重力作用使细胞悬液过滤过尼龙网筛（孔径70 μm）。此步骤可去除较大的非神经元细胞，从而获得更佳的单细胞悬液。
- 将收集的细胞接种至多聚-D-赖氨酸包被的预培养皿中，在5% CO2、37°C培养箱中孵育20分钟。更换新的培养皿重复此步骤。星形胶质细胞及其他较重的细胞会沉降并贴附于培养皿底部，而小颗粒神经元及神经前体细胞则保持悬浮状态。孵育结束后，通过轻轻敲击培养皿即可使松散贴壁的小颗粒神经元和神经前体细胞脱落。
- 将小颗粒神经元和神经前体细胞收集至15 ml锥形管中，以200×g离心5分钟。弃去上清后，用1 ml无血清培养基重悬细胞沉淀，取10 μl aliquot部分使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 加入无血清培养基以达到所需细胞密度。中等密度接种的参考细胞数量如下：6孔板每孔接种350万至400万个细胞；4孔板每孔接种65万个细胞。对于6孔培养板，每孔接种1.5 ml；对于4孔板，每孔接种0.5 ml。细胞置于5% CO2、37°C培养箱中培养。24小时后首次完全更换培养基，之后每两到三天更换一次培养基。
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讨论
本方案基于以往报道过的实验步骤的改进3,7,11。以下将讨论若干需要注意的重要事项。
颗粒神经元和前体细胞在接种后2小时内即可贴壁。健康的细胞在相差显微镜下呈圆形形态4。接种后24小时内，健康细胞将均匀地铺展在盖玻片或塑料培养孔表面，并开始长出突起。首次换液时（接种后24小时），会观察到少量死亡的悬浮细胞，这属于正常现象，因为在解离过程中会有少量细胞死亡或状态不佳。然而，若在接种后48小时发现细胞成团聚集，且突起上出现串珠样膨大，则可能是细胞状态不佳，或聚-D-赖氨酸包被基质具有毒性。与大多数包被基质类似，聚-D-赖氨酸的效果具有批号依赖性，每一批新货均需进行测试。健康培养状态的图像可参见文献4,11,和20。健康细胞可在培养中维持长达两周8。
颗粒神经元前体细胞在接种后即开始分化8,12,13,14。一旦确定了适合您研究的接种密度，应保持该密度不变，因为细胞增殖受到如Notch信号通路等因素...
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致谢
感谢Barbara Carletti和Anna Marie Kenney提出的宝贵建议。HYL由培训项目“激素：生物化学与分子生物学”（DK07328）资助。部分经费由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目5R01 NS16951（CAM）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70μm 孔径的细胞筛 | BD Biosciences | 352350 | |
| 脊椎穿刺针 | BD Biosciences | 405182 | 20G × 3-1/2 英寸 |
| 聚-D-赖氨酸，分子量>300,000 | Sigma-Aldrich | P1024 | 每批新的聚-D-赖氨酸都必须进行测试。 |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| 青霉素-链霉素（100X） | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | 必须不含钙和镁。 |
| Neurobasal A 培养基 | Invitrogen | 10888-022 | |
| Glutamax I 添加剂 | Invitrogen | 35050-061 | |
| B-27 无血清添加剂（50X） | Invitrogen | 17504-044 | |
| 12 mm 圆形盖玻片 | Carolina Biological | 63-3029 | 由德国 Deckglaser 公司生产。 |
| 25 mm 圆形盖玻片 | Carolina Biological | 63-3037 | 由德国 Deckglaser 公司生产。 |
| Papain 解离系统试剂盒 | Worthington Biochemical | LK 003150 | 该试剂盒可用于五次分离实验。 |
| Permaset 剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont #5（Dumostar） | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| 4 孔培养皿 | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 6 孔培养皿 | Nalge Nunc international | 140685 |
参考文献
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