本文介绍了一种从出生后小鼠中分离并培养小脑颗粒神经元前体细胞及小脑颗粒神经元的方法。
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本文内容
摘要
摘要
小脑皮层是一个结构特征明确的脑区，为研究神经元特性及其发育过程提供了独特的机会1,2。在小脑的各类神经元（颗粒细胞、浦肯野细胞和抑制性中间神经元）中，颗粒神经元数量最多，是哺乳动物大脑中最丰富的神经元类型。在啮齿类动物中，小脑颗粒神经元由小脑皮层最外层——外颗粒层（EGL）中的前体细胞在出生后前两周内生成。本文所述方案介绍了从小鼠出生后小脑组织中富集并培养颗粒神经元及其前体细胞的技术。我们将描述一系列纯度逐步提高的培养方法3,4，可用于研究增殖性前体细胞向颗粒神经元的分化过程5,6。当前体细胞完成分化后，这些培养物还可提供均一的颗粒神经元群体，用于实验操作及对突触形成、谷氨酸受体功能7、与其他纯化的小脑细胞的相互作用8,9或细胞死亡7等现象进行表征研究。
方案
第1部分：准备工作（解剖前1-2天）（视频中未展示）
- 准备培养液和培养基：
- 4X CMF-PBS-EDTA（用于Percoll稀释的无钙镁磷酸盐缓冲液-EDTA）：每升加入32 g NaCl、1.2 g KCl、8 g葡萄糖、2 g NaH2PO4、1 g KH2PO4、8 ml 2% NaHCO3储备液、10 ml 1M EDTA（pH 8.0）至去离子/蒸馏水中。定容至1升，并调节pH至7.4。过滤除菌。
- HBSS-葡萄糖：向无钙镁的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中加入葡萄糖（6克/升），过滤除菌。500 ml可于4°C保存最多一个月。
- 培养基：无血清培养基（SFM）和含10% FBS的培养基。向48 ml Neurobasal A培养基中加入500 μl 100X GlutaMAX I、500 μl 100X青霉素-链霉素（终浓度为100单位青霉素和100 μg链霉素）、6.25 μl 2 M KCl（终浓度250 μM）。将混合液分为两份，分别为9 ml和40 ml。制备含10% FBS的培养基时，向9 ml分装液中加入1 ml热灭活FBS。制备SFM时，向40 ml分装液中加入800 μl无血清添加剂B-27。过滤除菌后于4°C保存，最多保存2周。为获得最佳效果，建议每次实验前新鲜配制培养基。
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讨论
本方案基于以往报道过的实验步骤的改进3,7,11。以下将讨论若干需要注意的重要事项。
颗粒神经元和前体细胞在接种后2小时内即可贴壁。健康的细胞在相差显微镜下呈圆形形态4。接种后24小时内，健康细胞将均匀地铺展在盖玻片或塑料培养孔表面，并开始长出突起。首次换液时（接种后24小时），会观察到少量死亡的悬浮细胞，这属于正常现象，因为在解离过程中会有少量细胞死亡或状态不佳。然而，若在接种后48小时发现细胞成团聚集，且突起上出现串珠样膨大，则可能是细胞状态不佳，或聚-D-赖氨酸包被基质具有毒性。与大多数包被基质类似，聚-D-赖氨酸的效果具有批号依赖性，每一批新货均需进行测试。健康培养状态的图像可参见文献4,11,和20。健康细胞可在培养中维持长达两周8。
颗粒神经元前体细胞在接种后即开始分化8,12,13,14。一旦确定了适合您研究的接种密度，应保持该密度不变，因为细胞增殖受到如Notch信号通路等因素.......
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致谢
感谢Barbara Carletti和Anna Marie Kenney提出的宝贵建议。HYL由培训项目“激素：生物化学与分子生物学”（DK07328）资助。部分经费由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目5R01 NS16951（CAM）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70μm 孔径的细胞筛 | BD Biosciences | 352350 | |
| 脊椎穿刺针 | BD Biosciences | 405182 | 20G × 3-1/2 英寸 |
| 聚-D-赖氨酸，分子量>300,000 | Sigma-Aldrich | P1024 | 每批新的聚-D-赖氨酸都必须进行测试。 |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| 青霉素-链霉素（100X） | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | 必须不含钙和镁。 |
| Neurobasal A 培养基 | Invitrogen | 10888-022 | |
| Glutamax I 添加剂 | Invitrogen | 35050-061 | |
| B-27 无血清添加剂（50X） | Invitrogen | 17504-044 | |
| 12 mm 圆形盖玻片 | Carolina Biological | 63-3029 | 由德国 Deckglaser 公司生产。 |
| 25 mm 圆形盖玻片 | Carolina Biological | 63-3037 | 由德国 Deckglaser 公司生产。 |
| Papain 解离系统试剂盒 | Worthington Biochemical | LK 003150 | 该试剂盒可用于五次分离实验。 |
| Permaset 剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont #5（Dumostar） | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| 4 孔培养皿 | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 6 孔培养皿 | Nalge Nunc international | 140685 |
参考文献
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells<....
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