E-选择素介导白细胞在微血管内皮上生理滚动的分析
2009年2月11日
本报告以可视化方式展示了在生理剪切应力条件下研究白细胞与内皮细胞相互作用的平行板流动腔分析方法。该方法特别适用于研究内皮细胞选择素（E-选择素）及其白细胞配体在介导白细胞沿内皮细胞表面滚动过程中的作用。
本视频展示了利用平行板流动腔分析来研究触发白细胞在内皮细胞表面滚动的因素。内皮细胞单层经促炎性细胞因子IL-1β刺激后，上调S选择素的表达。随后将平行板流动腔置于内皮细胞上，并将S选择素阳性的白细胞灌注到单层细胞表面。
因此，腔室中的细胞相互作用受到与毛细血管后微静脉中白细胞黏附相似的剪切应力。使用NIS元件捕获并计数滚动事件，并进行E-选择素依赖性检测。大家好，我是乔治·韦斯（George Weis），来自哈佛医学院布莱根妇女医院皮肤科查尔斯·德尼特罗（Charles de Nitro）博士的实验室。
今天，我们将向您展示一种在生理血流条件下分析E-选择素及其配体在人白细胞与人骨髓内皮细胞黏附过程中作用的实验方法。我们实验室利用该方法研究细胞表面分子在白细胞或转移性癌细胞与血管内壁内皮细胞初始黏附过程中的作用。这种黏附事件表现为类似保龄球沿球道滚动的滚动行为。
那么我们开始吧。该实验步骤的第一步是准备将用于铺满流动腔的内皮细胞。本方案使用来源于人骨髓的H-B-M-E-C 60细胞。
微血管培养皿应预先用纤维连接蛋白包被，以准备这些培养皿：用含有20微克/毫升纤维连接蛋白的PBS孵育35毫米组织培养皿。可于4摄氏度下孵育过夜，或在37摄氏度下孵育3小时。将H-B-M-E-C 60细胞悬浮于199培养基中，以每皿10的5次方个细胞的密度接种，培养至细胞融合度超过90%。
这需要大约两天时间以促进E选择素的上调和表达，吸除培养基后加入含有50纳克/毫升IL-1β的新鲜培养基，在37摄氏度下孵育4至6小时。此时细胞单层已准备好用于流式腔室实验。另外的H-B-M-E-C 60细胞培养板可用IL-1β刺激，并在37摄氏度下用20微克/毫升的中和性抗人E选择素抗体处理1小时。
这将用于对照 e-选择素的功能性表达。接下来，制备 e-选择素阳性的白细胞。这些细胞是 KG1a，一种人类造血祖细胞。
将这些细胞在RPMI 1640培养基中悬浮培养至汇合，或调整至每毫升含10⁶个细胞。KG-1a细胞可直接从培养物中移取，并在血细胞计数板上进行计数。用含10毫摩尔HEPES或HH缓冲液的HBSS重悬细胞，使细胞浓度为每毫升10⁶个，并加入2毫摩尔氯化钙。
将细胞置于冰上保存，直至进行检测。接下来的步骤包括准备显微镜、平行板流动腔和注射泵。进行检测时，打开显微镜和注射泵。
在显微镜上选择10倍物镜。将一个50毫升锥形管放入支架中，并用含2毫摩尔氯化钙的HH缓冲液填充。然后将5毫升塑料试管置于下方支架中。
接下来，将一个60毫升注射器放入注射泵中。确保注射器的活塞和筒身均固定牢固。将一个三通旋塞阀连接到60毫升注射器的末端，然后再将一个5毫升注射器连接到该三通旋塞阀上。
将平行流室装置放置在显微镜载物台上，输入管位于右侧，输出管位于左侧，真空管位于后方。将管路连接至真空源后，打开通气阀，使平行板装置吸附于载物台上。此步骤用于检测流室的真空密封裙边是否气密。
确认密封后，关闭气阀。现在将输出管路连接到已接在注射器上的三通旋塞阀上。此时装置已准备就绪，可置于 H-B-M-E-C 60 细胞上方。
打开真空泵，轻柔地将流室装置放至平板上，使装置被吸紧。此时应无空气泄漏的声音，必要时可对装置施加压力，以压缩橡胶垫圈。真空建立后，将输入管插入50毫升离心管中。
打开三通旋塞至60毫升注射器一侧，将泵置于泵送模式，以排出管路中的空气，同时避免抬起培养板上的细胞。使用设定为每分钟2毫升的注射泵填充进液管，然后迅速调整至每分钟0.5毫升。
在液体即将到达装置之前，必须仔细地对系统进行预冲洗，避免产生气泡，因为气泡会将单层细胞从培养板上掀起。一旦液体进入60 mil注射器，即完成流室和注射泵的预冲洗。现在，用胶带将流室的进液管、出液管和真空管分别固定在显微镜载物台上，以确保流室稳定。
这可确保在观察和采集数据时视野保持恒定。流动腔现已准备就绪，可供使用。每次细胞进样运行以及每次更换新培养板时，均应重复上述步骤。
为了捕捉Lucas位点滚动事件，在桌面打开NIS元素软件，点击播放图标以获取实时图像。使用自动曝光功能可使您看到培养板并聚焦图像。请通过手动调节显微镜的焦距，确保显微镜已正确聚焦在细胞单层上。
当图像对焦后，将曝光率重置为每秒一帧，并调节显微镜的光照强度。此时图像应显示在计算机上，而不再在显微镜中可见。随后可调整光强直方图，以去除背景曝光或提高细胞清晰度，点击“2×2 bin”或“live bin”以获得适合视频采集的理想图像。
单击菜单栏上的宏，选择“右端口”，然后选择 COM3 端口并打开。此操作将打开端口，使其与注射泵协调工作。现在，流动室已准备好注入 KG1a 细胞。将 1 mL KG1a 细胞悬液用移液器加入靠近进样管路的 5 mL 试管中。
然后将输入线放置到试管底部。转到菜单栏，点击“capture”和“time lapse acquisition”，选择持续时间为210秒的程序。
这是针对 H-B-M-E-C 60 细胞滚动实验的程序时长。每个阶段均设定为在泵运行程序持续期间，每隔一秒拍摄一张图像。同时，程序还设置为通过通信三号端口发送指令以启动泵。
将注射泵设置为程序模式，以便手动编程设定特定的流速。这将决定腔室内的剪切应力水平，并调控KG1a细胞与HBMEC-60细胞之间的相互作用。这些相互作用的设定条件为4.2达因/平方厘米，持续45秒。
以每平方厘米3达因为起点，持续60秒，之后每15秒递增一次，直至最大值每平方厘米4.2达因。显微镜和计算机现已准备就绪，可开始采集延时摄影图像。启动计算机上的“开始运行”按钮，同时运行程序以开始采集数据。
务必向含有 KG one A 细胞的管中添加培养基，以确保输入输出管路充满培养基，并防止气泡进入系统。如果延时拍摄被中断，泵不会自动停止，必须手动重置。按取消键以返回实时图像。
未刺激的内皮细胞单层作为本实验的阴性对照。为此，将KG1a白细胞灌注到未经处理的H-B-M-E-C 60细胞的流动腔室中，以排除E-选择素依赖性的影响；另将内皮细胞单层用IL-1β刺激后，再将白细胞灌注至这些细胞上，进一步排除E-选择素依赖性的影响。将H-B-M-E-C 60细胞先用IL-1β处理，再用抗人S-选择素抗体处理。
然后分析这些细胞上的白细胞滚动事件。白细胞滚动不仅由S选择素决定，还受到白细胞表面唾液酸残基的影响。为证明这一点，将KG-1a细胞在37°C条件下用0.1单位/毫升的神经氨酸酶消化1小时。
然后分析刺激后的H-B-M-E-C 60细胞上的滚动事件。白细胞表面的糖蛋白对于细胞滚动也具有重要作用。可通过将KG one A细胞在37摄氏度下用0.2单位/毫升的broma lane处理1小时，然后将其注入流式腔室来验证这一点。
时间序列采集完成后，数据即可用于分析。保存数据后，转到菜单栏的“measure”选项卡，选择“defined threshold”。移动滑块，使目标细胞显示为红色，选择所有图像，然后点击确定，整个延时序列现在应被修改为显示红色滚动细胞。
转到“测量”并选择限制条件。此操作允许用户排除不代表滚动细胞的阈值对象。这些对象主要是由H-B-M-E-C 60单层细胞的选择区域产生的背景。请设置最小值和最大值，这些参数适用于滚动的白细胞。
对伸长率和圆形度重复此步骤。选择“测量”，然后选择“使用限制条件创建二值图像”。此前一步中设定的相同限制值将用于优化NIS元素软件，以识别内皮细胞单层上的滚动白细胞。返回到“测量”，选择“区域数据”，然后选择“重置数据”。
关闭菜单，返回测量界面并选择扫描区域，打开测量区域数据，选择数量或对象。然后选择所有区域并将数据导出至 Microsoft Excel。最后，选择清除数据。
NIS 元素现已准备就绪，可进行更多数据采集。这些代表性数据展示了白细胞与内皮细胞相互作用如何响应生理剪切应力，特别是用于检验黏附配体 E 选择素的作用。
当内皮细胞预先用IL-1β刺激后，可观察到稳定的白细胞滚动现象。与未刺激的对照组相比，显然细胞滚动依赖于细胞因子的刺激。通过用IL-1β处理H-B-M-E-C 60细胞，再加入抗人E-选择素抗体，结果表明细胞滚动特异性地依赖于E-选择素。
该实验也可用于检测其他参数。例如，当刺激的细胞预先用sase或brolin处理时，结果的显著性会降低。这些数据强调了末端唾液酸残基以及细胞表面糖蛋白的重要性。
关于S选择素配体活性，我们刚刚展示了如何在模拟后微静脉（即白细胞离开血液进入组织的循环系统区域）中所存在的剪切力条件下，分析白细胞与内皮细胞之间基于E选择素的黏附相互作用。进行此实验时，重要的是要记住使用适当的阻断抗体或酶处理对照，以验证该实验体系中相应选择素及其配体的必要性。以上就是全部内容。
感谢观看，祝您的实验顺利。
概述
本报告通过可视化方式展示了用于研究生理剪切应力下白细胞-内皮细胞相互作用的平行板流动腔分析方法。该方法特别适用于研究内皮细胞选择素（E-选择素）及其白细胞配体在介导白细胞沿内皮细胞表面滚动过程中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 白细胞滚动是免疫反应中的关键步骤。
- 内皮细胞在介导白细胞黏附中发挥重要作用。
- 理解这些相互作用可为炎症性疾病提供新的认识。
- 平行板流动腔室可模拟生理条件，用于研究这些过程。
研究目的
- 分析E-选择素在白细胞黏附中的作用。
- 研究在剪切应力条件下白细胞与内皮细胞之间的相互作用。
- 提供进行平行板流动腔实验的详细操作方案。
使用的方法
- 使用 H-B-M-E-C 60 细胞制备内皮细胞单层。
- 用 IL-1β 刺激细胞以上调 E-选择素表达。
- 将 E-选择素阳性的白细胞注入流室。
- 利用成像软件捕获并计数滚动事件。
主要结果
- 成功可视化白细胞在内皮细胞上的滚动现象。
- 展示E-选择素对白细胞黏附的影响。
- 建立一种可靠的研究白细胞-内皮细胞相互作用的方法。
- 揭示生理条件下白细胞滚动的机制。
结论
- 平行板流动腔是研究白细胞动力学的有效工具。
- E-选择素在介导白细胞滚动过程中发挥重要作用。
- 该方法可应用于炎症和免疫应答的进一步研究。
常见问题
行业重要性概述
了解E-选择素介导的白细胞滚动可为早期炎症过程提供机制性见解，有助于抗炎治疗药物研发中的靶点验证。这种基于生理流动的检测方法可在受控剪切应力条件下定量评估内皮细胞与白细胞之间的相互作用，提高对靶点结合及信号通路调控的预测可靠性。该方法通过在与疾病相关的微血管环境中分离特定黏附分子的作用，支持临床前阶段的风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：探究E-选择素在白细胞募集中的功能作用，从而能够验证炎症通路参与的假设。
- 操作价值：提供可重复的系统，利用阻断抗体或酶处理来验证靶点特异性。
- 预测价值：通过量化滚动频率和抗剪切能力作为靶点调控的功能性读数，支持决策是否推进研究（“继续/终止”决策）。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：在定义的剪切应力条件下，生成标准化且可量化的输出结果，包括每视野内的滚动事件次数和黏附效率。
- 可重复性：使用 NIS-Elements 软件设定阈值，并将分析限定于滚动的白细胞，从而最大限度减少数据采集中的主观性。
- 可扩展性：可在不同细胞系和处理条件下重复运行，采用一致的预处理和真空密封方案。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟在皮肤、骨骼及炎症组织中白细胞的迁移过程，这些组织中E-选择素为组成性或可诱导性表达。
- 机制性风险排除：通过IL-1β刺激和抗E-选择素抗体对照，区分E-选择素依赖性与非依赖性的滚动行为。
- 转化连续性：将体外滚动行为与体内渗出过程相联系，支持白细胞-内皮细胞黏附通路相关生物标志物的一致性验证。
流程与工作流整合
该检测适用于从靶点验证到临床前评估的整个发现过程，可提供关于白细胞-内皮细胞相互作用的机制性见解，从而指导先导化合物的优化和安全性分析。
- 发现生物学：在生理剪切力条件下检测E-选择素及其配体在白细胞黏附中的必要性，阐明其在炎症级联反应中的靶标功能。
- 筛选：提供基于成像的定量读数（滚动频率、结合效率），可对不同遗传或药理学干预条件下的结果进行比较。
- 分析：将数据导出至Excel，用于对抗剪切力黏附进行统计分析，支持剂量-反应关系和抑制剂特征分析。
- 转化研究：利用人骨髓内皮细胞和造血祖细胞，模拟具有临床相关性的白细胞-内皮细胞相互作用。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于在炎症、免疫肿瘤学和血管生物学研究项目中开展选择素介导的黏附研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过可控的刺激与抑制，明确分离E-选择素在白细胞滚动中的作用，从而降低机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的腔室制备、剪切应力分析以及使用NIS-Elements进行自动图像分析，确保实验的可重复性。
- 战略价值：在接近生理条件的环境下，提供靶点与白细胞相互作用的直接功能证据，从而提高靶点的可信度。
- 项目影响：基于在特定血流动力学条件下对滚动过程的定量抑制效果，支持对抗黏附治疗药物进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、细胞因子刺激和微流控流动动力学方面的专业知识，以维持单层细胞的完整性和稳定的剪切应力。
- 依赖于专用仪器，包括平行板流动腔、注射泵以及配备视频采集功能的倒置显微镜。
- 需要跨团队统一图像分析参数（如阈值、伸长率、圆形度），以确保滚动事件定量的一致性。
- 需调整白细胞和内皮细胞模型，以反映组织特异性的炎症环境（例如皮肤与骨微血管系统）。
- 仅限于分析初始黏附事件；若无其他辅助实验，无法捕捉牢固黏附或跨内皮迁移等后续过程。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Title
0:48
Introduction
1:36
Preparation of hBMEC Monolayer on Petri Dishes
3:03
Preparation of Human Hematopoietic Progenitor KG1a Cells
3:44
Preparation of Microscope, Parallel-Plate Flow Chamber and Syringe Pump
6:26
Capturing Leukocyte Rolling Events using NIS Elements
9:21
Dependence of Terminal Sialylation and Surface Glycoprotein for E-selectin-Mediated KG1a Cell Rolling
10:43
Analysis of NIS-Elements-Captured KG1a Cells and Graphing of KG1a Cell Rolling Data
12:27
Representative Results
13:35
Conclusion
