微血管内皮生理E -选择素介导白细胞滚动分析
February 11th, 2009
这份报告提供了一个平行板流动腔分析研究生理剪切应力下的白细胞内皮细胞相互作用的视像描划。调查的内皮细胞（E） - 选择素和白细胞E -选择素配体触发白细胞在血管内皮细胞表面滚动的作用，这种方法尤其有用。
本视频演示了平行板流室分析，用于检查触发内皮细胞表面白细胞滚动的因素。促炎细胞因子 IL one β 刺激内皮细胞单层，上调 S 选择素表达。然后将平行板流式室放置在内皮细胞上，并将 S 选择素阳性白细胞注入单层细胞。
因此，腔室中的细胞相互作用被赋予了类似于毛细血管后白细胞粘附的纯粹应力。使用 NIS 元件捕获和枚举滚动事件，并检测 E 选择独立性。嗨，我是哈佛医学院布里格曼妇女医院皮肤科 Charles de Nitro 博士实验室的 George Weis。
今天，我们将向您展示一种程序，用于分析生理血流条件下 E 选择素、E 选择素配体在人类白细胞与人骨髓内皮细胞粘附中的作用。我们在实验室中使用该程序来研究细胞表面分子的作用，这些分子启动白细胞或转移性癌细胞粘附到排列在血管内表面的内皮细胞上。这种粘附事件的特点是滚动行为，就像保龄球在球道上滚动一样。
那么让我们开始吧。该程序的第一步是准备将排列在流动室中的内皮细胞。该方案使用源自人骨髓的 H-B-M-E-C 60 细胞。
微血管系统培养皿应预先涂上纤连蛋白，以制备这些 35 毫升组织培养皿，其中含有每密耳纤连蛋白 20 μg 的 PBS。这些可以在 4 摄氏度下孵育过夜或在 37 摄氏度下孵育 3 小时。将 H-B-M-E-C 60 细胞悬浮在培养基 1 99 中，每培养皿接种 10 至第 5 个细胞，将培养物生长至 90% 汇合度以上。
这大约需要两天时间来上调 e 选择和表达，吸出生长培养基并加入每密耳 50 ng IL 的新鲜培养基，一个 β 孵育 4 到 6 小时。细胞单层现在可用于流通室测定。可以用 IL one β 刺激额外的 H-B-M-E-C 60 细胞板，并用 20 μg/mil 的中和抗人 e 选择素抗体在 37 摄氏度下处理 1 小时。
这将控制 e 选择素的功能表达。接下来，准备 e 选择素阳性白细胞。这些是 KG one，一种人类造血祖细胞。
这些细胞在悬浮液中生长以汇合或在 RPMI 1640 中趋向于每密耳 6 个细胞。KG one A 细胞可以直接从培养物中移液并在血细胞仪上计数。Resus 将细胞以每密耳 10 至 6 个细胞的浓度悬浮在 HBSS 中，并含有 2 毫摩尔氯化钙的 10 毫摩尔 hep 或 HH 缓冲液。
将细胞储存在冰上，直到它们被测定。接下来的步骤包括准备显微镜、平行板流通室和注射泵。对于分析，打开显微镜和注射泵。
在显微镜上选择 10 x 物镜。将 50 mL 锥形管放入支架中，并用含 2 毫摩尔氯化钙的 HH 缓冲液填充。然后将 5 毫升塑料试管放入下面的支架中。
接下来，将 60 毫升注射器放入注射泵中。确保注射器的柱塞和主体都牢固。将三通旋塞旋塞连接到 60 mil 注射器的末端，然后将 5 mil 注射器连接到三通旋塞旋塞上。
将平行流通室装置放在显微镜载物台上，输入管在右侧，输出管在左侧，真空管在后面。将管道连接到真空后，打开空气阀，让平行板装置粘附在载物台上。这将测试流通室上的真空裙板是否密封。
确认密封后，关闭空气阀。现在将输出管路连接到已经连接到注射器的三通旋塞上。该装置现在可以放置在 H-B-M-E-C 60 细胞上。
打开真空，轻轻地将流通室装置降低到板上，让装置向下吸。应该没有空气逸出的声音，此时您可能需要对腔室施加压力以压缩橡胶垫圈。真空建立后，将输入管放入 50 mL 锥形管中。
打开 60 mil 注射器的三通旋塞，将泵置于泵模式，以去除管路中的空气，而无需抬起板上的细胞。使用设置为每分钟 2 密耳的注射泵填充进气管。然后快速设置为每分钟 0.5 mils。
在液体到达设备之前，小心灌注设置并避免气泡至关重要，气泡会将单层从板中抬起。一旦流体进入 60 mil 注射器，流动室和注射泵就被灌注。现在，在每条输入、输出和真空管路上用一条胶带将腔室中的液流固定到载物台上。
这可确保在可视化和收集数据时视野保持不变。流通室现在可以使用了。应对每个细胞输入运行和每个新板重复这些步骤。
要捕获 Lucas 站点滚动事件，请在桌面上打开 NIS 元素，然后按实时图像的播放图标。自动曝光将允许您查看印版并聚焦图像。通过在显微镜上手动调整焦距，确保显微镜正确聚焦在细胞单层上。
图像聚焦后，将曝光重置为每秒一帧，并调整显微镜上的光线。图像应显示在计算机上，并且不应再在显微镜下可见。然后可以调整光直方图 要消除背景曝光或提高单元格清晰度，请单击 2 x 2 分箱或实时分箱以获得理想的电影捕捉图像。
单击菜单栏上的宏，然后选择 right to port，选择端口 com 3 并打开。这将打开端口以与注射泵协调。流动室现在已准备好注入 KG one A 细胞，将 1 mil KG one A S 悬浮液移液到输入管线附近的 5 mil 试管中。
然后将输入线放在试管的底部。转到菜单栏，然后单击 Capture 和 Time lapse acquisition。选择持续 210 秒的协议。
这是在 H-B-M-E-C 60 单元上滚动的程序长度。每个阶段都被编程为在泵协议的持续时间内每秒拍摄一张照片。它还设置为通过 comm three 端口发送命令以启动泵。
将注射泵设置为编程模式，允许对特定流速进行手动编程。这将确定腔室内的绝对应力水平，并决定 KG one A 细胞在 H-B-M-E-C 60 细胞上的相互作用。这些交互的设置为每平方厘米 4.2 次用餐，持续 45 秒。
每60 秒增加每平方厘米 3 点，每 15 秒增加一次，最多为每平方厘米 4.2 点。显微镜和计算机现在可以拍摄延时摄影了。在计算机上按 start run 开始在运行程序时获取数据。
确保将培养基添加到含有 KG one A 细胞的试管中，以保持输入输出管充满培养基并防止气泡进入系统。如果延时中断，泵不会自行停止，必须重置。按取消可返回实时图像。
未刺激的内皮细胞单层作为该实验的阴性对照。为此，将 KG one A 白细胞注入未经处理的 H-B-M-E-C 60 细胞上的流动室中，以控制 e 选择独立性，用 IL one β 刺激内皮细胞单层，并将白细胞注入这些细胞上以进一步控制 eect 独立性。用 IL one β 处理 H-B-M-E-C 60 细胞，然后用抗人 S 选择素抗体处理。
然后分析这些细胞上的白细胞滚动事件。细胞滚动不仅由 S 选择素决定，还由白细胞细胞表面的切片酸残基决定。为了证明这一点，在 37 摄氏度下用 0.1 单位/mil 神经氨酸酶消化 KG one A 细胞 1 小时。
然后分析刺激的 H-B-M-E-C 60 细胞上的滚动事件。白细胞表面的糖蛋白对细胞滚动也很重要。这可以通过在 37 摄氏度下用每密耳 0.2 个单位的溴泳道处理 KG one A 细胞 1 小时，然后将它们注入流动室来证明。
获取时间序列后，数据即可用于分析。保存数据并转到 measure 选项卡，然后选择 defined threshold。移动条形，使所需的单元格显示为红色，选择所有图像，然后确定，现在应该用可见的红色滚动单元格修改整个延时序列。
转到 measure 并选择 restrictions。这允许用户排除不表示滚动单元的阈值对象。这些主要是由 H-B-M-E-C 60 单层选择区域和输入最小值和最大值创建的背景，这对于滚动的白细胞来说是理想的。
对伸长率和圆度重复此步骤：选择度量，然后选择使用限制创建二进制。在上一步中设置的相同限制值现在将用于优化 NIS 元件软件，以识别内皮细胞单层上滚动的白细胞。返回 measure select field data，然后选择 reset data。
关闭菜单，返回测量并选择扫描字段，打开测量字段数据，然后选择数字或对象。然后选择所有字段并将数据导出到 Microsoft Excel。最后，选择 Clear data （清除数据）。
NIS 元素现在已准备好进行更多数据收集。这些代表性数据显示了白细胞内皮细胞相互作用如何响应生理性纯粹应激，特别是测试粘附配体的作用。E selectin.
当内皮细胞被 IL one β 预先刺激时，就会发生强大的白细胞滚动。当将此结果与未刺激的对照进行比较时，很明显细胞滚动依赖于细胞因子刺激。通过用 IL one β 处理 H-B-M-E-C 60 细胞，然后用抗人 E 选择素抗体处理，很明显细胞滚动特异性依赖于 e 选择素。
该测定也可用于测试其他参数。例如，当用 sase 或 brolin 预处理刺激的细胞时，结果不太可靠。这些数据突出了末端硅酸残基以及细胞表面糖蛋白的重要性。
对于 S 选择素配体活性，我们刚刚向您展示了如何在模拟毛细血管后静脉（白细胞离开血液并进入组织的循环系统区域）中存在的力的条件下分析白细胞和内皮细胞之间基于 e 选择素的粘附相互作用。执行此程序时，请务必记住使用适当的封闭抗体或酶处理对照，以验证该检测系统中相应选择素及其配体的必要性。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本报告提供了一种平行板流动室分析的视觉描述，用于在生理剪切应力下研究白细胞和内皮细胞的相互作用。这种方法特别适用于研究内皮细胞(E)选择素和白细胞E选择素配体在内皮细胞表面诱发白细胞滚动的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 白细胞滚动是免疫反应中的关键步骤。
- 内皮细胞在介导白细胞粘附中起关键作用。
- 了解这些相互作用可以为炎症性疾病提供见解。
- 平行板流动室模拟生理条件，用于研究这些过程。
研究目的
- 分析E选择素在白细胞粘附中的作用。
- 研究剪切应力下白细胞和内皮细胞之间的相互作用。
- 提供进行平行板流动室测定的详细协议。
使用的方法
- 使用H-B-M-E-C 60细胞制备内皮细胞单层。
- 用IL-1 beta刺激细胞以上调E选择素表达。
- 将E选择素阳性白细胞注入流动室。
- 使用成像软件捕获和统计滚动事件。
主要结果
- 成功可视化了白细胞在内皮细胞上的滚动。
- 证明了E选择素对白细胞粘附的影响。
- 建立了一种研究白细胞-内皮细胞相互作用的可靠方法。
- 洞察了在生理条件下白细胞滚动的机制。
结论
- 平行板流动室是研究白细胞动力学的有效工具。
- E选择素在介导白细胞滚动中起重要作用。
- 该方法可应用于炎症和免疫反应的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding E-selectin-mediated leukocyte rolling provides mechanistic insight into early inflammatory processes, supporting target validation for anti-inflammatory therapeutic development. This physiologic flow-based assay enables quantitative assessment of endothelial-leukocyte interactions under controlled shear stress, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. The method supports preclinical de-risking by isolating the contribution of specific adhesion molecules in a disease-relevant microvascular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of E-selectin in leukocyte recruitment, enabling hypothesis testing of inflammatory pathway involvement.
- Operational Value: Provides a reproducible system to validate target specificity using blocking antibodies or enzymatic treatments.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by quantifying rolling frequency and shear resistance as functional readouts of target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable outputs including rolling events per field and tethering efficiency under defined shear stress conditions.
- Reproducibility: Uses NIS-Elements software to define thresholds and restrict analysis to rolling leukocytes, minimizing subjectivity in data capture.
- Scalability: Enables repeated runs across cell lines and treatment conditions with consistent priming and vacuum sealing protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models leukocyte trafficking in cutaneous, bone, and inflamed tissues where E-selectin is constitutively or inducibly expressed.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes E-selectin-dependent from independent rolling using IL-1β stimulation and anti-E-selectin antibody controls.
- Translational Continuity: Links in vitro rolling behavior to in vivo extravasation, supporting biomarker alignment for leukocyte-endothelial adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, providing mechanistic insight into leukocyte-endothelial interactions that inform lead optimization and safety profiling.
- Discovery Biology: Tests the necessity of E-selectin and its ligands in leukocyte adhesion under physiologic shear, clarifying target function in inflammatory cascades.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts (rolling frequency, binding efficiency) that enable comparison across genetic or pharmacological perturbations.
- Analytics: Exports data to Excel for statistical analysis of shear-resistant adhesion, supporting dose-response and inhibitor profiling.
- Translational Research: Uses human bone marrow endothelial cells and hematopoietic progenitor cells to model clinically relevant leukocyte-endothelial interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying selectin-mediated adhesion across inflammation, immuno-oncology, and vascular biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating E-selectin’s contribution to leukocyte rolling through controlled stimulation and inhibition.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized chamber preparation, shear stress profiling, and automated image analysis with NIS-Elements.
- Strategic Value: Improves target confidence by providing direct functional evidence of target-leukocyte interaction under near-physiologic conditions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-adhesion therapeutics based on quantitative inhibition of rolling under defined hemodynamic forces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, cytokine stimulation, and microfluidic flow dynamics to maintain monolayer integrity and consistent shear stress.
- Depends on specialized instrumentation including parallel-plate flow chamber, syringe pump, and inverted microscope with video capture capability.
- Necessitates cross-team standardization of image analysis parameters (threshold, elongation, circularity) to ensure consistent rolling event quantification.
- Requires adaptation of leukocyte and endothelial cell models to reflect tissue-specific inflammation contexts (e.g., dermal vs. bone microvasculature).
- Limited to analyzing initial adhesion events; does not capture downstream processes like firm adhesion or transmigration without complementary assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:48
Introduction
1:36
Preparation of hBMEC Monolayer on Petri Dishes
3:03
Preparation of Human Hematopoietic Progenitor KG1a Cells
3:44
Preparation of Microscope, Parallel-Plate Flow Chamber and Syringe Pump
6:26
Capturing Leukocyte Rolling Events using NIS Elements
9:21
Dependence of Terminal Sialylation and Surface Glycoprotein for E-selectin-Mediated KG1a Cell Rolling
10:43
Analysis of NIS-Elements-Captured KG1a Cells and Graphing of KG1a Cell Rolling Data
12:27
Representative Results
13:35
Conclusion
