Name: 主电穿孔的小鼠骨髓造血细胞培养制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学习使用Gene Pulser MXCell电穿孔系统对小鼠骨髓造血细胞进行分离、培养和转染的方法。该方法可实现约30%的转染效率，并支持肥大细胞和嗜碱性粒细胞的分化研究。

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从股骨和胫骨中采集骨髓
<ol>
<li>该操作的第一步是从6至12周龄小鼠的股骨和胫骨中采集骨髓（我们使用的是BALB/c小鼠，但该操作适用于任何品系的小鼠）。首先，通过吸入CO2对小鼠实施安乐死（此处不展示）。从每只小鼠的后肢取下股骨和胫骨。然后，用剃须刀片切除股骨两端，去除髋关节和膝关节，以暴露骨髓。</li>
<li>以类似方式，切除胫骨两端，去除邻近膝关节和踝关节的区域，以暴露骨髓。</li>
<li>取一支3 mL注射器，安装26号针头，并吸入含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素和β-巯基乙醇（BME = 100 uM）的RPMI培养基。用镊子夹住骨骼，将其置于含有RPMI培养基的培养皿上方。将注射器针头插入骨骼一端，推动活塞以冲洗出骨髓。可在骨骼内部上下移动针头，以充分冲洗残留的骨髓。</li>
<li>对所有骨骼重复上述操作，随后开始建立培养体系。</li>
</ol>
建立培养物
<ol>
<li> 为建立骨髓培养，用移液器将冲洗出的骨髓组织反复吹打数次，以将组织分散成单细胞悬液。</li>
<li>将一个70微米滤膜置于50 mL锥形离心管上，然后将细胞悬液加入滤膜中。</li>
<li>用RPMI冲洗一次培养皿，再将冲洗液加入70微米滤膜中。</li>
<li>使用1 mL注射器活塞的橡胶端，研磨残留在70微米滤膜上方的骨髓组织碎片。</li>
<li>用RPMI冲洗滤膜一次。</li>
<li>冲洗后，将细胞悬液在1200 rpm下离心5分钟。</li>
<li>通过在PBS中重悬，洗涤细胞沉淀。</li>
<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。通常从小鼠骨骼（两根股骨加两根胫骨）可获得约9000万个细胞。计数后，再次以1200 rpm离心5分钟。</li>
<li>将细胞重悬于少量RPMI中，并分装至组织培养瓶中，加入足量RPMI使最终细胞浓度为每毫升100万个细胞。</li>
<li>添加细胞因子以促进目标细胞类型的发育。本实验中加入细胞因子白细胞介素-3（IL-3 = 10 ng/mL）以促进嗜碱性粒细胞和肥大细胞的发育。如需获得嗜碱性粒细胞，培养10天；如需获得肥大细胞，则需培养5周。在培养肥大细胞期间，应每周更换一次培养基和IL-3。</li>
<li>此图为刚接种后肥大细胞的形态。该图像展示了加入白细胞介素-3后10天，骨髓细胞向嗜碱性粒细胞和肥大细胞分化的结果。</li>
<li>获得目标细胞类型后，进行电穿孔步骤。</li>
</ol>
&nbsp;
电穿孔细胞
<ol>
<li>开始电穿孔步骤时，确定培养瓶中的细胞数量。</li>
<li>细胞通常以每毫升1000万个的密度进行电穿孔，因此将所需数量的细胞转移至锥形管中，并在1200 rpm下离心5分钟。</li>
<li>离心后，吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞，再以1200 rpm离心5分钟。</li>
<li>吸除PBS，加入Bio-Rad Gene Pulser电穿孔缓冲液，制备成每毫升含1000万个细胞的细胞悬液。</li>
<li>重悬细胞后，加入所需浓度的质粒DNA，终浓度为每毫升10至20微克。</li>
<li>将150微升细胞悬液分装至96孔电穿孔板中选定的孔内。</li>
<li>将电穿孔板放入MXcell板腔中，并关闭盖子。</li>
<li>在转染肥大细胞之前，除非使用预设或已存储的程序，否则必须将电穿孔程序设定至MXcell设备中。通过优化实验我们发现，使用方波脉冲程序可获得最高的肥大细胞转染效率。我们将在板上设置不同的电穿孔条件，以2000 µF和1000欧姆的参数分别施加300 V/20 ms、350 V/15 ms、350 V/20 ms和350 V/10 ms的方波脉冲。程序设定并加载到设备后，按下“Pulse”按钮对细胞进行电穿孔。</li>
<li>电穿孔完成后，将细胞转移至组织培养板中。通常将每份150微升的电穿孔样品转移至48孔组织培养板的一个孔中，孔内已含有300微升RPMI培养基（添加10%胎牛血清、青霉素、链霉素和β-巯基乙醇）以及每毫升10纳克的白细胞介素-3。细胞在37°C孵育过夜，24小时后检测表达与抑制情况。</li>
</ol>
转染结果
视频中展示了使用每毫升20微克GFP质粒成功进行电穿孔后细胞的荧光显微镜图像。使用MXcell电穿孔系统可获得约30%的转染效率。该系统允许您调节条件以最大化转染效率，同时保持细胞活力。

随着越来越多的基因组信息涌现以及siRNA等新工具的开发，使用生理相关性细胞对于进一步理解疾病通路、蛋白质相互作用和信号转导变得愈发重要。原代细胞直接从组织或体液中获取，并在体外进行培养。这些细胞可通过多种方式进行操控，包括引入外源性遗传物质。目前越来越明确的是，将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效的方法是电穿孔法。
电穿孔通过使细胞暴露于电脉冲中，暂时增加细胞膜的通透性，从而允许外源核酸进入细胞。这种转染方法可根据不同细胞类型或细胞系的差异进行优化，因此可用于转染肥大细胞以及任何其他骨髓来源的细胞。此外，与病毒介导的转染不同，电穿孔对转染DNA的大小没有限制，也无需复杂的准备工作。与脂质体介导的转染相比，电穿孔的毒性更低，且不会导致转染核酸被困在内吞体中。
伯乐公司已为这些细胞专门开发了MXcell电穿孔系统。该系统可让您调整条件，以最大化转染效率和细胞存活率。为了优化转染效率并最小化细胞死亡，可调节并评估多种电穿孔参数，包括电压、电容、电阻和脉冲时长。

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser MXcell 电穿孔系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser 电穿孔缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

电穿孔正日益显现出其作为将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效方法的优势。Gene Pulser MXcell 电穿孔系统与Gene Pulser 电穿孔缓冲液专为向哺乳动物细胞以及难转染细胞（如原代细胞和干细胞）转染核酸而设计。本视频演示了如何从小鼠骨髓建立原代造血细胞培养，并为其在MXcell系统中进行电穿孔做准备。我们首先分离股骨和胫骨，收集来自股骨和胫骨的骨髓，建立细胞培养。随后对培养的骨髓细胞进行转染并分析。

关键词：电穿孔，原代细胞，质粒DNA，siRNA，Gene Pulser MXcell，Gene Pulser 电穿孔缓冲液，核酸转染，哺乳动物细胞，原代造血细胞，小鼠骨髓，股骨，胫骨，干细胞

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell 电穿孔系统进行转染。

人们日益认识到，电穿孔是将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效的方法。Gene Pulser ...

该实验程序首先采集小鼠的股骨和胫骨。在去除髋关节、膝关节和踝关节后，通过向骨骼的开放端注入 RPMI 培养基来分离骨髓。获得单细胞悬液后，将骨髓细胞诱导分化为肥大细胞，随后接种至 96 孔电穿孔板中并进行转染。使用基因脉冲或MX细胞电穿孔系统。采用方波脉冲程序，可获得约30%的转染效率。该实验步骤的第一步是从6至12周龄小鼠的股骨和胫骨中收集骨髓。首先通过吸入 CO2 对小鼠实施安乐死，从每只小鼠的后肢采集股骨和胫骨。然后使用刀片切除股骨两端，去除髋关节和膝关节，以暴露骨髓，操作方法应保持一致。切除胫骨两端，去除膝关节和踝关节邻近区域，以暴露骨髓。接下来，取一支带有26.5号针头的注射器，吸入添加了10% FBS、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇、头孢他啶乙醇和L-谷氨酰胺的RPMI培养基。用镊子夹住骨骼，置于含有RPMI培养基的培养皿上方。将注射器针头插入骨骼的一端，推动活塞以冲洗出骨髓。可在骨内上下移动注射器针头，以冲洗出残留的骨髓。对所有骨骼重复此操作，然后继续进行骨髓培养的建立。为建立骨髓培养物，需将冲洗出的骨髓反复吹打数次，以将组织分散成单细胞悬液。然后将一个70微米的滤膜置于50毫升锥形管上方，将细胞悬液加入滤膜中。接着用RPMI冲洗一次培养皿。然后用1毫升注射器活塞的橡胶端将冲洗液加入70微米滤膜，并研磨残留在70微米滤膜上方的骨髓组织块。用 RPMI 洗涤滤膜一次。将细胞悬液在 1200 RPM 下离心五分钟。通过在 PBS 中重悬细胞沉淀来洗涤细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞进行计数。通常从小鼠的骨骼（两只股骨和两只胫骨）中可获得约9000万个细胞。计数后，以1200 RPM的转速离心5分钟。用少量 RPMI 重悬细胞，并将其分装至组织培养瓶中，加入足量 RPMI，使最终细胞浓度为每毫升100万个细胞。然后添加细胞因子以促进目标细胞类型的发育。在此示例中，添加细胞因子白细胞介素-3以促进嗜碱性粒细胞和肥大细胞的发育；如需获得嗜碱性粒细胞，需培养10天；如需生成肥大细胞，则需培养五周。培养基和白细胞介素3应每周更换一次。以下是骨髓细胞在接种后即刻的形态示意图。此图像显示了在添加白细胞介素3后10天，骨髓细胞分化为嗜碱性粒细胞和肥大细胞的情况。获得目标细胞类型后，继续进行电穿孔步骤。开始电穿孔前，需确定培养物中的细胞数量。通常，培养瓶中的细胞以每毫升1000万个的密度进行电穿孔。将所需数量的细胞转移至锥形管中，在1200 RPM条件下离心5分钟。离心后吸弃上清液，用1倍PBS洗涤细胞，再以1200 RPM离心5分钟。随后吸弃PBS，加入BioRad基因脉冲电穿孔缓冲液，制备成每毫升含1000万细胞的细胞悬液。重悬细胞后，加入所需质粒DNA，终浓度为每毫升10至20微克。轻轻混匀细胞溶液，将150微升细胞悬液加入96孔电穿孔板中选定的孔内。接下来，将电穿孔板放入MXL板腔中，并在对骨髓细胞进行转染和电穿孔前盖上盖子。除非使用预设或通过优化实验储存的程序，否则必须将程序编入MXL。经过优化实验，我们发现使用方波脉冲程序可获得最高的骨髓细胞转染效率。我们将在培养板上调整电穿孔条件，以在1000欧姆电阻下传递2000微秒的方波脉冲。一旦程序设置完成并加载到设备上，按下脉冲按钮对细胞进行电穿孔。电穿孔完成后，将细胞转移至组织培养板中。我们通常将每个150微升的电穿孔样品转移至含有300微升RPMI培养基（含10纳克/毫升白细胞介素-3）的48孔组织培养板中的一个孔内。细胞在37摄氏度下孵育过夜，24小时后检测其表达与抑制情况。这是一张细胞的荧光显微镜图像。使用 MX 细胞电穿孔系统，以每毫升 20 微克的 GFP 质粒进行电穿孔后，可获得约 30% 的转染效率。该系统允许您调整条件，在保持细胞活力的同时最大化转染效率。MX 细胞系统特别适用于此类小鼠造血细胞等原代哺乳动物细胞。我们刚刚向您展示了如何从小鼠中分离骨髓细胞，并使用MX细胞电穿孔系统转染已分化的肥大细胞。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

主电穿孔的小鼠骨髓造血细胞培养制备

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