Name: 在鸡胚神经诱导的含量为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学习鸡胚神经诱导实验方法，利用Hensen结移植和原位杂交技术观察神经命运决定过程。本视频展示荧光标记、组织培养和神经标记物检测的完整操作流程，为发育神经科学研究提供可视化指导。

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D.P. 获得美国国家药物滥用研究所颁发的露丝·柯施坦因奖（Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1）。本工作得到Margaret M. Alkek基金会对RHF的资助。

一、示意图概述：
<img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="神经组织原位杂交实验示意图；细胞移植；供体-受体设置；异位轴诱导。" width="460" height="384" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1">
本视频展示了鸡胚神经诱导实验的各个步骤。首先，将宿主胚胎移植到新培养体系中 [NI1]。随后，将供体胚胎置于生理盐水中，并用荧光染料DiI标记亨森结（Hensen’s node，即鸡胚中的“组织者”）[NI2]。从供体胚胎中切除亨森结 [NI3]，并将其移植至宿主胚胎 [NI4, NI5]。之后将宿主胚胎培养最多22小时，在此期间，供体组织已在宿主的外胚层区域诱导形成异位轴结构 [NI6]。培养结束后，固定宿主胚胎并进行光氧化处理，过程中使用DAB：通过该化学反应，来源于供体的细胞在光氧化前在FITC荧光下呈红色 [NI7]，与DAB反应后则变为棕色 [NI8]。随后对胚胎进行原位杂交处理，使用神经标记物进行检测 [NI8]；结果显示，在供体移植物存在的情况下，宿主来源的组织已形成神经组织，该组织呈现蓝色。
1：为New培养法准备宿主胚胎
<ol>
<li>该神经诱导检测实验方案从孵化至哈amburger与Hamilton 3+期（或HH3+期）的鸡胚开始。这些鸡胚已在湿润的培养箱中侧放孵育13小时。</li>
<li>准备用于New培养的宿主胚胎（步骤3.1至5.59）。</li>
<li>用200 μl生理盐水覆盖宿主胚胎表面，以利于后续供体移植物的转移和定位。</li>
<li>最后，用倒置的Falcon 35 mm培养皿覆盖整个装置。</li>
</ol>
2：在生理盐水中分离供体胚胎
<ol>
<li>用镊子轻敲蛋壳并移除蛋壳各处的碎片，打开鸡蛋。取下蛋壳顶部并丢弃。</li>
<li>用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。</li>
<li>使用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入含有PBS的培养皿中。</li>
<li>用镊子将供体胚胎从明区分离。</li>
<li>将供体胚胎转移至含有PBS的Sylgard包被培养皿中。</li>
</ol>
3：供体移植物的标记、切除与移植
<ol>
<li>使用微电极拉制仪拉制 50 μl 玻璃微量毛细移液管。在显微镜下，用精细镊子剪断微量移液管的尖端。将微量移液管放置在铺有塑泥条的培养皿中。</li>
<li>配制用于移植前标记移植物的染料溶液：碳菁染料 DiI（1,1’-二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）：首先，将 DiI 溶于 1 ml 无水乙醇中，配制成 0.5% 的储存液。该储存液可于 -20°C 避光保存。在设定为 42°C 的水浴中，将预热的 40 μl DiI 储存液与 360 μl 0.3 M 蔗糖混合。水浴温度对于防止 DiI 沉淀和不溶性晶体形成至关重要。将溶液短暂离心（使用微型离心机，离心 5–10 秒）。此时 DiI 溶液已可使用。</li>
<li>使用昆虫针将供体胚胎固定在涂有 Sylgard 的培养皿底部。</li>
<li>用 DiI 溶液反向填充微量移液管。通过使用吸管装置施加轻微压力，将少量 DiI 溶液注入亨森结（Hensen’s node）。确保整个亨森结被充分标记。</li>
<li>使用微量毛细移液管或显微解剖刀，切下亨森结（“组织者”，供体移植物）。</li>
<li>用胭脂红在移植物的腹侧和后端做标记。这将确保在步骤 4.3 中移植物能以正确的背腹方向定位。</li>
<li>使用 200 μl Gilson 移液器将移植物转移至宿主胚胎。</li>
</ol>
4：固定移植物并培养宿主胚胎
<ol>
<li>移除宿主胚胎中的生理盐水，确保移植物仍紧邻宿主部位放置。</li>
<li>使用微毛细移液管或显微解剖刀，在宿主胚胎亨森结（Hensen’s node）水平的明区/暗区交界区域做一个小切口（80–100 μm）。</li>
<li>使用微毛细移液管或显微解剖刀，调整移植物位置，使其腹侧朝向操作者，后端与宿主胚胎相应区域平行。</li>
<li>除去残留的生理盐水，并将宿主胚胎进行New培养，持续81–22小时（步骤6.1至6.69）。</li>
<li>随后将宿主胚胎在4°C下固定过夜（步骤7.1至7.79）。</li>
</ol>
5：在荧光下对移植物进行光氧化
<ol>
<li>在通风橱内，用 Tris 缓冲液配制 DAB 工作液：将 DAB 底物（3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐）溶解于 Tris 缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 7.4）中，终浓度为 500 μg/ml；溶液避光并置于冰上保存。</li>
<li>用 PBS 洗涤胚胎两次，每次 5 分钟，再用 Tris 缓冲液洗涤一次，持续 5 分钟。</li>
<li>将胚胎转移至含有 1 ml Tris 缓冲液的玻璃凹面载玻片中。</li>
<li>用 1.5 ml DAB 溶液替换 Tris 缓冲液。将移液器吸头弃入装有 10% 次氯酸钠溶液的容器中，以去除 DAB 污染。在凹面载玻片上加盖盖玻片。</li>
<li>在 FITC（异硫氰酸荧光素）荧光下，将显微镜物镜聚焦于移植物上（供体细胞呈红色荧光），并暴露于 FITC 荧光下，直至所有红色荧光细胞变为棕色（此过程是由于 DiI 荧光染料在 DAB 存在下，经 FITC 激发光（488 nm）照射后，光转化生成不溶性棕色结晶所致）。该过程耗时约 20 分钟至 2 小时。</li>
<li>光氧化反应完成后，用精细镊子移去盖玻片。将胚胎转移至含有 PBTw（或含 0.1% Tween-20 的 PBS）的 20 ml 玻璃闪烁瓶中。</li>
<li>通过将盖玻片和玻璃凹面载玻片在 10% 次氯酸钠溶液中孵育，以灭活残留的 DAB。</li>
</ol>
6：对胚胎进行原位杂交、拍照和切片处理
<ol>
<li>进行原位杂交（步骤 3.7 至 6.59），仅用 DIG 标记的探针孵育胚胎。</li>
<li>进行拍照（步骤 8.29）和切片（步骤 8.3 和 8.49）。</li>
</ol>
代表性结果
在以下神经诱导实验示例中，供体移植物显示出可诱导宿主来源组织表达神经标志物Tailless。在此特定示例中，我们评估了正常情况下不具备“组织者”能力的胚胎区域获得神经诱导能力的情况：供体移植物来源于一个在3+期通过手术去除“组织者”区域的供体胚胎。消融后，供体胚胎在New培养体系中继续发育，直至缺损愈合，并形成类似亨森结（Hensen’s node）的结构。该结构随后用DiI标记，从供体胚胎中切除，并移植至宿主胚胎的明区/暗区交界处。经过New培养后，在宿主胚胎旁形成一个微型轴状结构：该微型轴由一束红色细胞（供体来源）和一个头部样结构（宿主来源）组成。在图（A）中，于固定前在FITC荧光显微镜下观察到供体来源的DiI标记细胞。这些供体来源的细胞已增殖形成微型脊索，表现为一束红色细胞。图（B）中，在DiI光转化后，这些供体来源的细胞呈棕色。供体移植物诱导了宿主来源神经组织的形成：该组织包含脑部前体细胞，这一点通过原位杂交检测到标志物Tailless的表达得以证实[引自6]。
<img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure%202.png" alt="显微镜下组织荧光的组织学对比图；图像A中显示明亮的红色染色。" width="230" height="154" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图2">
注意：在此实验步骤中，我们使用了DiI标记的细胞，以便区分具有神经诱导能力的供体组织（红色/棕色）与宿主来源的“神经”组织（蓝色）。除了使用鸡源性的DiI标记供体移植物外，一些研究者也采用鹌鹑胚胎来源的供体组织替代鸡源组织 [例如 6]。这种替代方法同样能够区分供体与宿主组织。在此情况下，移植物（供体组织）来源于鹌鹑蛋而非鸡蛋。在完成步骤4.5后，对宿主进行整体免疫组织化学染色，使用特异性识别鹌鹑组织的抗体（QCP1），此时省略本方案中的步骤3.1至3.4以及5.1至5.7。以下展示该替代方法的一个示例：本实验中采用了与A、B相同的操作流程，但使用了鹌鹑来源的供体组织（如QCPN抗体表达所示[棕色]）：源自鹌鹑胚胎的再生脊索结已诱导宿主中泛神经标记物Sox2的表达 [转载自6]：
<img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure%203.png" alt="突出显示色素定位的植物有色体显微图像。" width="154" height="230" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图3">

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos%2C+cultivated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li>
<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+et+transplantation+des+diff%26eacute%3Brentes+r%26eacute%3Bgions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Ass.+Anat%22%5BJournal%5D)">Excision et transplantation des diff&eacute;rentes r&eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+induction+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Morph.+9%22%5BJournal%5D)">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li>
<li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li>
<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li>
<li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+%28New+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li>
</ol>

本视频展示了进行神经诱导检测的各个步骤；该检测主要用于鉴定鸡胚中潜在的神经诱导分子，因此可广泛应用于多种研究，范围从胚胎学显微操作1-4; 6到揭示新的信号级联通路7,8，其最终目标均为理解脑及其余神经系统形成过程中的初始步骤。

<table><tbody><tr><td>卵</td><td>动物</td><td>查尔斯河实验室</td><td>优质可育</td><td>受精后，HH3+期（14小时）</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>MZ9.5 或类似物</td><td></td></tr><tr><td>杂交孵育箱</td><td>仪器设备</td><td>Robbins Scientific，SciGene</td><td>M1000</td><td>与倒置的Pyrex培养皿和500 ml ddH₂O联用&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;烧杯</td></tr><tr><td>Marsh 自动培养箱</td><td>仪器设备</td><td>里昂</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 培养皿 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钟表匠&amp;rsquo;s 玻璃 50毫米</td><td>工具</td><td>VWR 国际</td><td>66112-060</td><td></td></tr><tr><td>玻璃环</td><td>工具</td><td>物理植物设施</td><td></td><td>切割4毫米厚的玻璃管（外径27毫米，内径25毫米）。无需精细抛光。</td></tr><tr><td>弯头镊子 (1)</td><td>工具</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>镊子（2）</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td>使用磨刀石将末端磨平，并加入100 μl矿物油</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>工具</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>橡胶球囊</td><td>工具</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>吸液管组件</td><td>工具</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>显微技术&amp;#8211;电极拉制仪</td><td>仪器设备</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown 微量移液器</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德毛细吸管</td><td>工具</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>70950-12</td><td>火焰下圆边</td></tr><tr><td>培养室</td><td>工具</td><td>先锋塑料</td><td>030C</td><td></td></tr><tr><td>微毛细管</td><td>工具</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>用于原位杂交前穿刺组织空腔</td></tr><tr><td>0.2 mm直径的微型针</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>将1份固化剂与9份基质混合，37°C过夜孵育</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>试剂</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础剂</td><td></td><td>道康宁</td><td>0001986475</td><td>将1份固化剂与9份基质混合，37°C过夜孵育</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>向1升PBS中加入1毫升DEPC；振荡混匀；高压灭菌</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td></td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr></tbody></table>

鸡胚神经诱导检测方法

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易操作性和可及性，使其成为研究神经系统形成及初始图式建立的理想模型。本视频演示了如何将组织中心组织移植到宿主中，该方法是将鸡胚中的组织中心——亨森结（Hensen's node）移植至具有发育潜能的宿主外胚层。组织中心移植物通过释放神经诱导信号，指导其上方未分化的组织转变为神经命运。这一机制被称为神经诱导，是羊膜动物脑和脊髓形成的第一步。该方法主要用于在鸡胚中鉴定潜在的神经诱导分子。本视频展示了神经诱导实验的各个步骤：首先，取出供体胚胎并固定于培养皿中；随后，准备宿主胚胎以进行新培养法（New culture）操作；接着，切下移植物并移植至宿主明区边缘区域；宿主胚胎继续培养18–22小时；最后，将样品固定并进行后续处理（如原位杂交）。该方法最初由瓦丁顿（Waddington）建立。

关键词：鸡胚，神经诱导，组织中心，亨森结，移植物，外胚层，原位杂交，Waddington 1,2和加莱拉3,4.

神经诱导是大脑形成的第一个步骤。该过程是一种由亨森结（组织中心）指导邻近组织获得神经命运的机制，即发育形成神经系统。本视频演示了在鸡胚中进行神经诱导实验的方法。

鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易接近性和易于操作的特点，使其成为……

本视频展示了鸡胚神经诱导检测中的各个步骤。首先，将宿主胚胎移植到新的培养环境中，将供体胚胎置于生理盐水中并用荧光染料标记亨森结节。从供体胚胎中切除亨森结节，并将其移植到宿主胚胎中。将宿主胚胎培养24小时后，进行固定，并在飞荧光下进行光氧化处理。用DAB显色。随后对胚胎进行原位杂交处理，使用神经标记物进行检测。您好，我是来自休斯顿德克萨斯农工大学环境与基因组医学中心Fennell实验室的Delphine。今天我们将向您展示在鸡胚中进行神经诱导实验的操作流程。在实验室中，我们利用该方法研究抗癫痫药物对亨森结（Hensen's node）神经诱导特性的影响。那么我们开始吧。对于神经诱导实验，需要准备鸡蛋。这些鸡蛋应平放在湿润的培养箱中孵育13小时，直至达到汉堡-汉密尔顿3期加（Hamburger-Hamilton stage 3+）或HH 3+期。接下来，采用之前已演示过的新培养方法准备宿主胚胎。在 JoVE 中，用 200 微升生理盐水覆盖宿主胚胎表面。这将有助于后续供体移植物的转移和定位。最后，用倒置的 Falcon 35 毫米培养皿覆盖组装好的装置。为暴露供体胚胎，用镊子轻敲蛋壳以打开鸡蛋。移除蛋壳顶部并丢弃。用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。去除蛋清后，用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄中取出，放入含有PBS的培养皿中。接下来，使用镊子将供体胚胎从卵黄和明区分离。分离后，将供体胚胎转移至含有 PBS 的 SIL 护罩培养皿中，用于标记和移植移植物。在显微镜下使用微电极拉制仪拉制 50 µL 玻璃微量毛细移液管。使用精细镊子剪去微量移液器的尖端。将微量移液器放置在铺有条状油灰的培养皿中。接下来，配制染料溶液，用于在移植前对移植物进行标记。首先，将0.5%的染料溶于1毫升无水乙醇中，配制染料母液。该母液可在避光条件下于-20 °C保存。然后，在45 °C的加热金属块中，将预热的10 µL染料母液与90 µL 0.3 mol/L蔗糖溶液混合。此温度条件对于防止染料沉淀及不溶性晶体的形成至关重要。将溶液在小型SPECT离心机上短暂离心5到10秒。DAI溶液现已准备好使用。用昆虫针将供体胚胎固定在培养皿底部，使胚胎背侧朝上，并置于凹槽防护罩内。胚胎固定后，通过施加轻柔压力，用D眼溶液回填微量移液器。使用吸管装置。将少量dai注入亨森结。重复操作，确保整个亨森结均被标记。使用微毛细移液管或微解剖刀切取亨森结节，结节的背侧与腹侧可通过形态区分：背侧形成一条沟槽，而腹侧则较为平坦。如有必要，可用胭脂红粉末标记移植物的背侧，以确保移植物被正确放置于相应的背腹方向。使用10微升Gilson移液器，通过微毛细移液管将移植物转移到宿主胚胎中。将移植物移至靠近宿主胚胎亨森结（Henson's node）水平的明区（area lucita）与不透明边界区域。接下来，使用微毛细移液管或显微解剖刀在该区域制造一个80至100微米的小切口。在宿主胚胎亨森结（Henson's node）水平处，Lucita 区域呈现不透明边界。使用微毛细移液管或微解剖刀进行操作。将移植物放置到位，使其腹侧朝向操作者，后端与宿主胚胎相应区域平行。一旦定位准确，移除宿主胚胎周围的生理盐水，确保移植物始终保持与宿主部位紧密接触，随后按照我们先前提交的方法，将宿主胚胎进行新培养，培养时间为 18 至 22 小时。培养24小时后，将胚胎从培养箱中取出，并固定于 cigars dish 中。去除含 P-B-S-P-B-S 的溶液，替换为4%多聚甲醛。胚胎随后固定24小时。将固定液弃置到合适的危险废物容器中，并向固定皿中加入 PBS。待昆虫针去除后，用镊子移除昆虫针。使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有 PBS 的闪烁瓶中。用 PBS 清洗胚胎两次，每次五分钟；清洗后，再用 twist 缓冲液清洗一次，持续五分钟。将胚胎转移至含有 0.1 毫升 Tris 缓冲液的玻璃凹面载玻片中。用 0.1 毫升 DAB 溶液替换 Tris 缓冲液。将移液器吸头弃置于含有漂白液的容器中。为了去除DAB的污染，将盖玻片置于腔室载玻片上方，在FEI异硫氰酸荧光素荧光聚焦条件下进行操作。显微镜下移植物供体细胞的目标区域会呈现红色荧光，并持续暴露于FEI荧光照射下，直至所有红色荧光细胞转变为棕色。此过程是由于染料荧光素在FEI激发波长照射下发生光转化，生成不溶性棕色结晶所致。在存在DAB的情况下，产生488纳米的光。该过程耗时在20分钟至2小时之间。光氧化反应完成后，使用精细镊子移除盖玻片。将胚胎转移至含有PBTW或PBS（含0.1%吐温20）的20毫升闪烁瓶中。最后，通过孵育漂白溶液处理胚胎，以去除盖玻片、载玻片和玻璃腔室上的DAB活性，从而为观察做准备。进行原位杂交，仅用DIG标记的探针孵育胚胎。接着，按照JoVE视频二中所述方法开始拍照和切片。以下是一个神经诱导实验的示例。最初，移植物被放置在宿主胚胎的 lucita 区与 alpaca 区交界处。供体和宿主胚胎均为三期加阶段。培养九小时后，移植物开始分化，并诱导形成一个看似八期减阶段的微型头部结构。培养24小时后，经固定确认神经诱导已完成。随后对胚胎进行光氧化处理。最初，源自供体的染料标记的眼部细胞已增殖，形成一个微型的Noor，如图中红色所示。光氧化后，这些细胞呈棕色。随后对胚胎进行整体原位杂交处理，以检测神经标记物。O otx two 由 Bonelli 博士实验室培育。供体移植物被证明可诱导宿主来源组织中OTX2的表达。我们刚刚向您展示了如何在鸡胚中进行神经诱导检测。进行此操作时，需注意在移植后用移液管吸除移植物周围区域的所有液体。这将确保移植物被牢固地固定在位，且在培养过程中不会从宿主胚胎上移开。就这些。谢谢。祝您观看愉快，并预祝您的实验顺利成功。

assay-for-neural-induction-in-the-chick-embryo

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在鸡胚神经诱导的含量为

多种生长因子和蛋白质相互作用，诱导细胞在发育过程中分化为不同的细胞命运。在此，我们通过在E2.5鸡胚上放置含有蛋白的琼脂糖珠，展示如何利用鸡胚内实验体系来研究不同蛋白质在发育过程中的潜在相互作用。...

在早期鸡胚上放置包被生长因子的微珠

本视频演示了如何利用在特定增强子元件调控下通过in...

利用 in ovo 电穿孔技术解析鸡胚神经管中遗传定义神经元群体的轴突通路

本文介绍了一种分析移植细胞（躯干神经嵴细胞）迁移的方法。该方法成本低廉、操作温和，能够区分趋化性与化学趋向性，以及源自原代躯干神经嵴细胞培养中细胞间相互作用等其他因素对迁移极性的影响。...

利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

本文描述了一种用于分析鹌鹑-鸡嵌合胚胎中鸟类神经嵴细胞迁移及其最终命运的研究方法。该方法是一种简单直接的技术，可用于追踪神经嵴细胞在迁移和分化过程中的动态，而在未经操作的鸡胚胎中，这些细胞通常难以被区分。...

通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

本视频演示了一种从早期鸡胚前脑中分离神经元并在微电极阵列上进行培养以形成神经元网络的方法。...

在多电极阵列上分离与培养鸡胚神经元

神经元网络如何在胚胎大脑中建立是发育神经生物学中的一个基本问题。在此，我们将电穿孔技术与新型遗传工具相结合，如在禽类后脑中使用Cre/Lox质粒和PiggyBac介导的DNA转座系统，以标记背侧中间神经元，并在不同发育阶段追踪其轴突投射及突触靶点。...

电穿孔法标记鸡胚后脑以示踪轴突投射路径及突触靶点

利用鸡胚GFP神经管移植与碳菁染料DiI注射对鸡胚中的神经嵴细胞与血管进行双重标记

该多功能实验方案描述了通过切除鸡胚头部神经褶来分离迁移前神经嵴细胞（NCCs）的方法。将神经褶外植体接种并培养后，迁移期的神经嵴细胞会从中迁移而出，从而可在简化的二维环境中对细胞形态和迁移行为进行评估。...

鸡颅神经嵴细胞培养物的制备与形态学分析

本方案旨在对鸡胚神经管形成过程中神经板组织的力学特性进行纵向监测。该方法结合了布里渊显微镜与载物台式培养系统，可实现神经板组织在活体状态下的力学成像 体外孵化...

监测鸡胚神经管闭合过程中组织的力学演变

学习鸡胚神经诱导实验方法，利用Hensen结移植和原位杂交技术观察神经命运决定过程。本视频展示荧光标记、组织培养和神经标记物检测的完整操作流程，为发育神经科学研究提供可视化指导。

鸡胚神经诱导检测方法

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