鸡胚神经诱导检测方法

本视频展示了鸡胚神经诱导检测中的各个步骤。首先，将宿主胚胎移植到新的培养环境中，将供体胚胎置于生理盐水中并用荧光染料标记亨森结节。从供体胚胎中切除亨森结节，并将其移植到宿主胚胎中。

将宿主胚胎培养24小时后，进行固定，并在飞荧光下进行光氧化处理。用DAB显色。随后对胚胎进行原位杂交处理，使用神经标记物进行检测。

您好，我是来自休斯顿德克萨斯农工大学环境与基因组医学中心Fennell实验室的Delphine。今天我们将向您展示在鸡胚中进行神经诱导实验的操作流程。在实验室中，我们利用该方法研究抗癫痫药物对亨森结（Hensen's node）神经诱导特性的影响。

那么我们开始吧。对于神经诱导实验，需要准备鸡蛋。这些鸡蛋应平放在湿润的培养箱中孵育13小时，直至达到汉堡-汉密尔顿3期加（Hamburger-Hamilton stage 3+）或HH 3+期。

接下来，采用之前已演示过的新培养方法准备宿主胚胎。在 JoVE 中，用 200 微升生理盐水覆盖宿主胚胎表面。这将有助于后续供体移植物的转移和定位。

最后，用倒置的 Falcon 35 毫米培养皿覆盖组装好的装置。为暴露供体胚胎，用镊子轻敲蛋壳以打开鸡蛋。移除蛋壳顶部并丢弃。

用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。去除蛋清后，用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄中取出，放入含有PBS的培养皿中。

接下来，使用镊子将供体胚胎从卵黄和明区分离。分离后，将供体胚胎转移至含有 PBS 的 SIL 护罩培养皿中，用于标记和移植移植物。在显微镜下使用微电极拉制仪拉制 50 µL 玻璃微量毛细移液管。

使用精细镊子剪去微量移液器的尖端。将微量移液器放置在铺有条状油灰的培养皿中。接下来，配制染料溶液，用于在移植前对移植物进行标记。

首先，将0.5%的染料溶于1毫升无水乙醇中，配制染料母液。该母液可在避光条件下于-20 °C保存。然后，在45 °C的加热金属块中，将预热的10 µL染料母液与90 µL 0.3 mol/L蔗糖溶液混合。此温度条件对于防止染料沉淀及不溶性晶体的形成至关重要。

将溶液在小型SPECT离心机上短暂离心5到10秒。DAI溶液现已准备好使用。用昆虫针将供体胚胎固定在培养皿底部，使胚胎背侧朝上，并置于凹槽防护罩内。胚胎固定后，通过施加轻柔压力，用D眼溶液回填微量移液器。

使用吸管装置。将少量dai注入亨森结。重复操作，确保整个亨森结均被标记。

使用微毛细移液管或微解剖刀切取亨森结节，结节的背侧与腹侧可通过形态区分：背侧形成一条沟槽，而腹侧则较为平坦。如有必要，可用胭脂红粉末标记移植物的背侧，以确保移植物被正确放置于相应的背腹方向。

使用10微升Gilson移液器，通过微毛细移液管将移植物转移到宿主胚胎中。将移植物移至靠近宿主胚胎亨森结（Henson's node）水平的明区（area lucita）与不透明边界区域。接下来，使用微毛细移液管或显微解剖刀在该区域制造一个80至100微米的小切口。

在宿主胚胎亨森结（Henson's node）水平处，Lucita 区域呈现不透明边界。使用微毛细移液管或微解剖刀进行操作。将移植物放置到位，使其腹侧朝向操作者，后端与宿主胚胎相应区域平行。一旦定位准确，移除宿主胚胎周围的生理盐水，确保移植物始终保持与宿主部位紧密接触，随后按照我们先前提交的方法，将宿主胚胎进行新培养，培养时间为 18 至 22 小时。

培养24小时后，将胚胎从培养箱中取出，并固定于 cigars dish 中。去除含 P-B-S-P-B-S 的溶液，替换为4%多聚甲醛。胚胎随后固定24小时。

将固定液弃置到合适的危险废物容器中，并向固定皿中加入 PBS。待昆虫针去除后，用镊子移除昆虫针。使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有 PBS 的闪烁瓶中。

用 PBS 清洗胚胎两次，每次五分钟；清洗后，再用 twist 缓冲液清洗一次，持续五分钟。将胚胎转移至含有 0.1 毫升 Tris 缓冲液的玻璃凹面载玻片中。用 0.1 毫升 DAB 溶液替换 Tris 缓冲液。将移液器吸头弃置于含有漂白液的容器中。

为了去除DAB的污染，将盖玻片置于腔室载玻片上方，在FEI异硫氰酸荧光素荧光聚焦条件下进行操作。显微镜下移植物供体细胞的目标区域会呈现红色荧光，并持续暴露于FEI荧光照射下，直至所有红色荧光细胞转变为棕色。此过程是由于染料荧光素在FEI激发波长照射下发生光转化，生成不溶性棕色结晶所致。

在存在DAB的情况下，产生488纳米的光。该过程耗时在20分钟至2小时之间。光氧化反应完成后，使用精细镊子移除盖玻片。

将胚胎转移至含有PBTW或PBS（含0.1%吐温20）的20毫升闪烁瓶中。最后，通过孵育漂白溶液处理胚胎，以去除盖玻片、载玻片和玻璃腔室上的DAB活性，从而为观察做准备。

进行原位杂交，仅用DIG标记的探针孵育胚胎。接着，按照JoVE视频二中所述方法开始拍照和切片。以下是一个神经诱导实验的示例。

最初，移植物被放置在宿主胚胎的 lucita 区与 alpaca 区交界处。供体和宿主胚胎均为三期加阶段。培养九小时后，移植物开始分化，并诱导形成一个看似八期减阶段的微型头部结构。

培养24小时后，经固定确认神经诱导已完成。随后对胚胎进行光氧化处理。最初，源自供体的染料标记的眼部细胞已增殖，形成一个微型的Noor，如图中红色所示。

光氧化后，这些细胞呈棕色。随后对胚胎进行整体原位杂交处理，以检测神经标记物。O otx two 由 Bonelli 博士实验室培育。

供体移植物被证明可诱导宿主来源组织中OTX2的表达。我们刚刚向您展示了如何在鸡胚中进行神经诱导检测。进行此操作时，需注意在移植后用移液管吸除移植物周围区域的所有液体。

这将确保移植物被牢固地固定在位，且在培养过程中不会从宿主胚胎上移开。就这些。谢谢。祝您观看愉快，并预祝您的实验顺利成功。