可行的小鼠IL - 17分泌性T细胞的检测和隔离

此过程描述了小鼠Th17细胞的白细胞，积极分泌刺激后，IL - 17的检测和隔离。

max 细胞因子分泌检测技术可在单细胞水平上检测分泌的细胞因子，并灵敏分离分泌细胞因子的活细胞，以标记分泌 IL 17 的细胞。制备小鼠白细胞的单细胞悬液，并在 37 摄氏度下用 PMA 离子霉素刺激，以诱导细胞因子分泌以停止分泌。然后将细胞置于冰上，在那里它们暴露于 IL 17 捕获试剂中。

一旦通过将温度升高到 37 摄氏度而重新开始分泌，IL 17 就会被捕获试剂捕获。与白细胞细胞表面的 CD 45 结合的双特异性抗体和在细胞表面分泌物附近被捕获的 IL 17 结合，然后通过将细胞置于冰上以检测被困的 IL 17 细胞与与生物素偶联的第二种 IL 17 特异性抗体一起孵育抗生物素 PE 抗体细胞现在可以通过流式细胞术直接分析或制备通过随后使用抗 PE 偶联微珠标记进行分离和富集。大家好，我是 Ellie Rankin，是 Mill Tenney Biotech 的科学家之一。

今天，我将向您展示如何分离和检测 TH 17 白细胞的程序，TH 17 白细胞在刺激后分泌 IL 17 IL 17 在适应性免疫和炎症反应中起重要作用，在驱动自身免疫性炎症中也很重要。那么，让我向您展示一下检测是如何完成的。对于今天的方案，我们首先需要制备含有 PBS 和 BSA 和两毫摩尔 EDTA 的缓冲液，因为气泡会堵塞最大分离柱，因此需要对缓冲液进行脱气并在使用前储存在 2 至 8 摄氏度。

其次，我们使用含有 5% 小鼠血清的 RPMI 1640 培养基。培养基不应含有 BSA 或 FCS，因为这些化合物会改变细胞刺激的特异性。最后，您需要 MIL 10 E Biotech 的小鼠 IL 17 分泌测定细胞富集和检测试剂盒。

该试剂盒包含以下组分：IL 17 捕获试剂、IL 17 检测抗体、生物素、抗生物素 pe 和抗 PE 微珠。从逻辑上讲，您可能会使用阴性和阳性对照（例如未刺激的 PLE 细胞和 T 细胞的复染剂）来执行此方案。在我们的演示中，我们将仅关注受刺激的细胞。

该协议将使用无菌技术进行。我们的方案从使用 Gentle max Associator 分离的小鼠 SP 细胞的单细胞悬液开始。细胞浓度应通过细胞计数预先确定。

在室温下以 200 G 的浓度沉淀细胞 10 分钟离心后，我们用移液管从沉淀物中吸出超级纳丁。不要倒出试管，以免沉淀损失。现在，应将细胞重悬于我们的培养基中，然后将其添加到培养基中，加入足够的培养基，使其浓度为每毫升 1000 万个细胞和每平方厘米 500 万个细胞。

为了刺激重悬细胞中的免疫反应，我们在样品中加入离子霉素和 PMA，并通过轻轻上下吹打来混合溶液。然后对井进行相应标记。现在我们将在 37 摄氏度下孵育三个小时，不混合以开始刺激期。

在刺激开始后 3 小时进行 IL 17 分析。因此，请相应地进行计划。在这里，我们看到了受刺激的小鼠脾细胞。

请注意受刺激细胞的不同形态和细胞聚集。为清楚起见，我们将仅跟踪受刺激的细胞。从这里开始，为了停止分泌，我们通过轻轻地上下吹打来收集受刺激的细胞。

然后用冷缓冲液将细胞从孔转移到试管中，并进行第二次洗涤。为确保收集所有细胞，最好在显微镜下检查您的培养皿。如果细胞仍然附着，您可以通过冲洗培养皿来收集剩余的细胞。

使用冷缓冲液，可以使用参与前过滤器去除细胞悬液中的任何细胞团块。该程序的一个潜在陷阱是捕获试剂的交叉污染，这可能发生在标记过程中。当双特异性抗体与非分泌 T 细胞结合并捕获邻近淋巴细胞分泌的 IL 17 时，从而产生假阳性以规避这个问题，在标记前冷却细胞并使用冷缓冲液以限制 IL 17 的分泌和缓慢扩散并避免这种交叉污染至关重要。

，如果存在超过 2% 的 IL 17 分泌细胞，也会发生交叉污染。如果预计分泌 IL 17 的细胞浓度大于 2%，则相应地调整体积。因此，除了保持细胞低温外，还必须将它们保持在规定的浓度。

为了开始标记程序，我们在 15 毫升的封闭管中使用 1000 万个细胞。如果必须使用更高的单元数，只需相应地增加所有体积即可。获得最佳细胞浓度后，加入 10 mL 冷缓冲液洗涤细胞。

后，在冷冻离心机中以 300 Gs 的速度离心细胞 10 分钟，使用移液器完全吸出上清液。不要倒出上清液，因为这会导致细胞丢失和体积不精确。重复洗涤步骤，包括加入 10 毫升冷缓冲液离心和吸液。

现在我们已经有了所需纯度的沉淀，将细胞重悬于任何微升的冷培养基中以标记它们。我们现在将添加 20 μL 小鼠 IL 17 捕获试剂。将细胞在冰上孵育 5 分钟。

在冰上孵育 5 分钟后，取出试管并在 37 摄氏度的 10 毫升中稀释细胞。暖介质。然后将试管固定在 Max mix 试管旋转器上，并在 37 摄氏度下孵育试管 45 分钟。

在连续运动下，将温度提高到 37 摄氏度将在 37 摄氏度的 45 分钟分泌期后重新启动细胞因子分泌。立即将试管放在冰上。这将阻止细胞因子分泌。

从这里开始，将细胞保存在冰上至关重要。使用冷缓冲液可避免捕获试剂的交叉污染。用冷缓冲液填充试管，并在 2 至 8 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟。

完全吸出 superber natin。再重复一次洗涤步骤。将细胞沉淀重悬于 80 μL 冷缓冲液中，并将试管置于冰上。

为避免抗体的非特异性结合，我们建议添加 10 μL FCR 封闭试剂，并在冰上孵育 5 分钟。然后，我们加入 20 μL 与生物素偶联的小鼠 IL 17 检测抗体，并在冰上孵育 10 分钟。再次像之前一样，加入 10 mL 冷缓冲液洗涤细胞，并在 2 至 8 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟。

现在吸出细胞沉淀并在 80 μL 冷缓冲液中重悬，并加入 20 μL 我们的二抗。抗生物素 pe。混合细胞和二抗溶液，然后再次在冰上孵育试管 10 分钟。

第二次孵育完成后，用 10 毫升冷缓冲液洗涤细胞并离心。沉淀现在可以重悬于 500 μL 的冷缓冲液中。如果必须分离细胞以进行进一步的下游分析，可以使用抗 PE 微珠对其进行磁性标记，并使用 max 色谱柱和 max 分离器手动或自动分离。

我们现在已经完成了 SPLU 细胞的标记，并准备好进行分析。我们将在运行前通过流式细胞术比较刺激和未刺激的 SP 细胞。事实：用每毫升 0.5 微克的碘化丙啶对细胞进行染色，以排除死细胞。

流式细胞仪的每个样品加载了 200， 000 个细胞，我们现在要查看样品中相对抗体反应性的散点图。通过流式细胞术分析稀有细胞（如 IL 17 阳性细胞）的两个重要考虑因素是在前向散射图与侧向散射图中对淋巴细胞设置设门，以及用碘化丙啶和 B 细胞选门死细胞染色，这可能会导致非特异性背景染色。为了进一步提高检测的灵敏度。

在这里，我们使用 CD 4 A PC 抗体检测 CD 45 RB 2 20 per CP 抗体中的 T 细胞。为了检测 B 细胞，我们观察样品的前向和侧向散射特性，并对淋巴细胞群关系进行步态分析。应用第二个门以查看 Y 轴上染色的死细胞和染色的 B 细胞。

这些细胞被排除在 T 细胞分析之外。在这个例子中，基本上是我们的阴性对照，我们可以看到在未刺激的样品中，很少有 IL 17 分泌 CD 四个阳性 T 细胞，大约 0.003%查看受刺激的 T 细胞群，我们可以看到大量分泌 IL 17 的 CD 四个阳性 T 细胞，分离前约为 0.367%，使用 max 技术进行磁分离后约为 60 点 76%。我们刚刚通过视频文档向您展示了如何使用 mul 10 biotech 的小鼠 IL 17 分泌检测试剂盒进行使用 pe 的细胞富集和检测试剂盒。

该程序最重要的部分是了解起始群体中分泌 IL 17 的细胞的频率。正确的细胞浓度将确保标记和细胞因子分泌期的交叉污染较少，从而确保可靠的结果。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。