ELISPOT实验：检测分泌IFN-γ的脾细胞

1. 准备工作

缓冲液与试剂

1. 无钙无镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）
2. 包被缓冲液——无菌 PBS 或碳酸盐缓冲液
3. 检测稀释液——含10%胎牛血清（FBS）的PBS
4. 细胞培养基 - RPMI 1640，含10% FBS、青霉素/链霉素 & L-谷氨酰胺
5. 洗涤缓冲液——含0.05% Tween20的PBS
6. 双蒸水（ddH₂O）₂O
7. 检测底物——100 mg AEC（3-氨基-9-乙基-咔唑）溶于10 mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中。

仪器设备

8. 层流罩
9. 加湿培养箱（设定为 37°C，5% CO₂）
10. 自动 ELISPOT 读板仪或解剖显微镜

材料

11. ELISPOT 板
12. 无菌和非无菌储液槽
13. 移液器及吸头
14. 无菌刻度移液管
15. 无菌锥形聚丙烯管
16. 两个用于洗板的挤压瓶

特定检测用试剂

17. 细胞——原代细胞或细胞系（此处使用C57BL/6小鼠的脾细胞）
18. 刺激物——有丝分裂原或抗原（此处使用佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA，50 ng/mL）和离子霉素（1 µM））
19. 一抗——生物素标记的抗细胞因子检测抗体（用检测稀释液稀释至2 µg/mL）
20. 二抗——链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SAv-HRP）

2. 实验步骤

包被

1. 在无菌条件下并在超净工作台内，将纯化的抗细胞因子捕获抗体用无菌包被缓冲液稀释至终浓度为 0.5–4.0 µg/mL。（注意：IFN-γ 和 IL-6 使用 5 µg/mL。）
2. 将捕获抗体溶液以 100 µL/孔转移至 ELISPOT 板中。
3. 用板盖覆盖板子并密封，防止蒸发。
4. 在 4°C 下孵育过夜。

封闭

5. 次日，在超净台中取出ELISPOT板。迅速将板倒置在无菌擦拭纸上，以去除每孔中的捕获抗体溶液。
6. 然后，向每孔加入200 µL细胞培养基。此步骤可阻断检测过程中非特异性结合。
7. 盖上板盖，将板在37°C下孵育2小时。

细胞铺板与活化

8. 在平板孵育的同时，用细胞培养基配制含有 50 ng/mL PMA 和 1 µM 离子霉素的 2X 有丝分裂原溶液。
9. 然后，将靶细胞悬液调整至储存浓度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL。
10. 孵育结束后，在超净工作台内将平板迅速倒置在无菌擦拭纸上，移除各孔中的细胞培养基。
11. 接下来，对储存的细胞悬液进行 2 倍系列稀释。首先，将 200 µL 已配制的细胞悬液原液加入 ELISPOT 板最上一排的各孔中。
12. 然后，在含有细胞原液的下一排开始，向接下来的五排每孔加入 100 µL 新鲜细胞培养基。
13. 随后，通过移液器将 100 µL 细胞悬液从最上一排转移至其正下方的一排，进行 2 倍系列稀释。为确保细胞均匀分布，需轻柔地上下吹打溶液以充分混匀。
14. 对剩余的四排重复此操作。
15. 第六排仅保留培养基，作为空白对照组。
16. 接着，向板中前五排的实验孔加入 100 µL 已配制的有丝分裂原溶液；在对照孔及第六排中，则加入 100 µL 不含有丝分裂原的细胞培养基。
17. 盖好板盖，将平板置于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 20–48 小时。（注意：检测 IL-2 和 TNF-α 通常 20–24 小时已足够，而检测 IL-4 和 IFN-γ 时，48 小时为最佳孵育时间）。

检测

一抗

18. 用检测稀释液将生物素标记的抗细胞因子检测抗体稀释至浓度为 2 µg/mL。
19. 此时配制 20–25 mL 洗涤缓冲液，即在 PBS 中加入 0.05% Tween-20 并混匀。
20. 孵育完成后，打开板盖，迅速将板倒置于水槽上方，以彻底移除各孔中的液体。（注意：此后不再需要保持板的无菌状态）。
21. 随后，向每孔加入约 200 µL 洗涤缓冲液进行洗涤。通过迅速倒置并在水槽上方轻弹板子，排出液体。重复此步骤，共洗涤五次。
22. 接着，向每孔加入 100 µL 稀释后的生物素标记抗细胞因子检测抗体溶液。于室温孵育 2 小时，或在 4°C 过夜孵育。

二抗

23. 孵育完成后，将板倒置并在水槽上方轻弹，排出检测抗体。
24. 同前，用约 200 µL 洗涤缓冲液洗涤板 5 次，每次洗涤之间彻底排出液体。
25. 随后向每个孔中加入 100 µL 稀释后的链霉亲和素-辣根过氧化物酶溶液（用检测稀释液稀释至预先确定的最佳浓度）。
26. 盖好板盖，在 37°C 下室温孵育 1.5–2 小时。

底物

27. 孵育结束后，在使用前不超过15分钟，首先根据制造商说明书激活AEC底物溶液。
28. 接着，弃去各孔中的内容物，并用洗涤缓冲液洗涤平板5次，方法同前。
29. 然后，立即向每孔中加入100 µL配制好的AEC底物溶液。
30. 在室温下孵育平板约10–20分钟，同时监测斑点的显色情况。
31. 通过用水冲洗平板并在水槽上方轻弹平板以终止反应。
32. 将平板在纸巾上轻轻吸干，并置于空气中过夜晾干，或直至完全干燥。移除平板下方的塑料托盘有助于加快干燥过程。

3. 数据采集与分析

1. 干燥后，斑点即可使用自动化酶标仪进行计数。此处使用的是 CTL Immunospot 酶标仪，但本方案可适用于任何型号的酶标仪。
2. 首先打开仪器，然后开启计算机。接着，打开 CTL 程序并点击 "扫描次数"
3. 推 "弹出" 使托盘从机器中伸出。然后，取下塑料适配器，并对齐排 "A" 在ELISPOT板和适配器上
4. 选择文件的保存名称和位置，并将酶标板加载到托盘上。
5. 然后，单击 "加载" 在软件上操作并关闭机器侧面的门。
6. 按压 "计数后开始。" 确保文件已保存，然后打开质量控制 "质量控制" 用于分析数据并计数斑点数量的软件。

注意事项：

1. 细胞的最少数量应在预实验中确定。每个孔的最佳斑点数量约为50个。如果加入的细胞过多，则难以分辨清晰的斑点。此外，细胞可能发生重叠，无法在膜上形成单层，从而降低检测水平。
2. 在优化实验时，应考虑目标蛋白的预期表达水平。表达水平越低，每孔所需的细胞数量就越多。
3. 与ELISA不同，建议手动洗涤板孔，而不是使用洗板机。ELISPOT板较为脆弱，应避免刺穿PVDF膜。
4. 在孵育期间应尽量减少板的移动，以免造成斑点模糊。
5. 板应避光保存，因为直接暴露在光线下会导致斑点褪色。