抗体生成：利用杂交瘤技术制备单克隆抗体

注意：在处理杂交瘤细胞和培养基时，应以无菌方式（例如在生物安全柜中）维持无菌细胞培养技术，直至抗体纯化步骤。

1. 解冻冻存的杂交瘤细胞

1. 将含有冻存杂交瘤细胞的小瓶置于37°C水浴中孵育，直至细胞刚刚解冻（约2分钟）。
2. 将解冻后的细胞加入含有10 mL完全RPMI培养基（RPMI添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、50 µM 2-巯基乙醇、10 mM HEPES）的15 mL锥形管中。
3. 以1200 RPM离心5分钟，以去除可能残留的冻存保护剂。
4. 离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL新鲜完全RPMI培养基中，然后将细胞加入含有15 mL完全RPMI培养基的T75组织培养瓶中（RPMI终体积为20 mL）。
5. 将细胞置于标准培养箱中，在37°C、5% CO₂条件下培养。细胞在培养过程中不贴壁生长。

2. 杂交瘤扩增

1. 将细胞培养约3天，直至培养瓶中细胞融合度达到约80%。
   注意：所需时间可能因起始细胞数量以及不同细胞固有的生长速率差异而有所不同。确保细胞处于对数生长期至关重要。
2. 当初始培养瓶中的细胞融合度达到约80%时，将细胞从该T75培养瓶中移出，转移至锥形离心管中，离心（1200 RPM，5分钟）以收集细胞沉淀。
3. 将细胞重悬于6 mL完全RPMI培养基中，然后将细胞悬液分装至三个新的T75培养瓶中（每瓶2 mL悬液，含18 mL RPMI）。将这三个T75培养瓶置于37°C、5% CO₂条件下培养，直至细胞融合度达到约80%（大约需要3天）。

3. 无血清培养基中的抗体生产

注意： 此时，细胞已准备好在专为杂交瘤细胞系生长设计的无血清培养基中继续培养。在本方案中，我们使用即用型、市售的 HB 基础液体培养基，其中含有 HB101 补充剂产品。

1. 收集三个T75培养瓶（约80%融合度）中的细胞，并进行离心（1200 RPM，5分钟）。
2. 将每个T75培养瓶中的细胞沉淀重悬于10 mL添加了补剂的HB101无血清培养基中，然后分别加入两个含有补充剂的HB101无血清培养基的T225培养瓶中（即将5 mL细胞悬液加入6个培养瓶中，每个培养瓶含约220–240 mL HB101培养基）。
3. 将细胞继续在T225培养瓶中、HB101培养基中于37°C、5% CO₂条件下培养三周，或直至细胞开始死亡。在此三周期间，细胞持续产生单克隆抗体（mAb）并分泌至培养基中。一旦细胞开始死亡，将不再产生任何mAb。

4. 抗体纯化 - 第1天

注意： 此时无需保持无菌，因此无需以无菌方式操作培养基（例如，在生物安全柜中操作）。此外，杂交瘤不被视为“生物安全二级（BSL2）”级别的生物因子。

1. 将培养瓶中的培养基倒入用于固定角转子的离心管中。使用固定角转子离心机以10,000 RPM离心8分钟。此步骤旨在去除培养上清液中的细胞碎片。
   注意：离心管的规格可能因所用转子而异。需注意的是，各离心管中的液体体积应保持一致，以确保离心前转子处于良好平衡状态。很可能无法一次性将全部培养基体积放入离心机中，剩余的培养基将在后续步骤（步骤4.5）中使用相同的离心管继续离心。
2. 准备一个装有搅拌子的2L塑料烧杯，将其置于盛有冰的容器中，并放置在搅拌器上。
3. 将一个500 mL滤头安装在1L瓶子上。通过合适的管路将瓶顶过滤装置连接至负压系统。
4. 将步骤4.1中获得的上清液（仍含有杂交瘤细胞产生的单克隆抗体）倒入滤头中。
5. 继续使用同一组离心管收集培养基中的细胞碎片沉淀（沉淀会持续累积）。在滤头未装满且下一批上清液尚未准备好时，暂不启动负压抽滤。切勿让滤膜变干，否则过滤速度将显著减慢。
6. 当1L瓶子接近装满时，取下滤头，将上清液倒入步骤4.2中准备好的2L烧杯中，然后重新装上滤头。注意记录总体积。
7. 重复离心和过滤步骤，直至所有培养基均被处理完毕。
8. 根据所收集的每1L过滤后上清液，称取295g硫酸铵。在持续搅拌条件下，于接下来的数小时内缓慢加入硫酸铵（约每15分钟加入25 g），以避免局部硫酸铵浓度过高，导致非目标蛋白发生沉淀。
9. 待所有硫酸铵完全加入后，用铝箔覆盖烧杯，并连同搅拌器一起转移至4°C环境（例如步入式冰箱或冷室）中，持续搅拌过夜。持续搅拌有助于盐的溶解，但长时间搅拌可能导致溶液表面/气液界面处的蛋白质发生变性。
10. 使用固定角转子清洗离心管。

5. 抗体纯化 - 第2天

1. 将含有硫酸铵的上清液从2L烧杯倒入固定角转子离心管中。使用固定角转子离心机以6500 RPM转速离心20分钟，期间不使用刹车。
2. 用真空抽吸法小心移除上清液，注意不要吸起沉淀，因为沉淀较为松软。继续使用同一组离心管收集含硫酸铵上清液中的沉淀。
3. 最后一次抽吸后，将每份沉淀（含有抗体）重悬于约1 mL PBS中。
4. 通过透析去除单克隆抗体溶液中的硫酸铵，透析液为大量PBS。具体操作如下：首先，为每1 mL单克隆抗体溶液准备约1英寸长的透析管（例如，Membra-Cel MD25-14，截留分子量12,000–14,000道尔顿的纤维素透析管）。用dH₂O润湿透析管。将透析管一端打结，注入dH₂O检查是否渗漏。确认无泄漏后，倒出管内dH₂O。
5. 用移液器将PBS/抗体溶液加入透析管中。用额外的0.25 mL PBS冲洗原离心管，并将冲洗液转移至透析管中。
6. 用橙色透析夹将透析管开口端尽可能靠近液面处夹紧密封。
7. 将透析管顶部用胶带固定在4L烧杯外侧上缘，使装有样品的透析管自然垂入烧杯内。向烧杯中加入PBS并放入搅拌子。
8. 在4°C条件下搅拌透析约8小时（过夜）。
9. 将烧杯中的PBS更换为新鲜PBS，再重复搅拌透析约8小时，共进行两次。
10. 将透析后的抗体从透析管转移至15 mL或50 mL锥形离心管中。以1200 RPM离心5分钟，去除可能形成的任何沉淀物。将上清液转移至新的离心管中。
11. 取部分抗体样品用PBS稀释20倍（5 µL抗体 + 95 µL PBS）。使用分光光度计在280 nm波长下测定抗体浓度（以PBS为空白对照）。采用消光系数（ε）为1.43。浓度计算公式如下：
    
    
12. 将抗体分装至带螺口盖的小瓶中，于-80°C保存。