抗体生成：利用杂交瘤技术制备单克隆抗体

抗体是研究和诊断的有力工具，因此通常需要大量生产抗体。

产生抗体的第一步是将目标抗原注射入宿主动物体内。该抗原会激活宿主的B细胞，随后B细胞产生并释放针对该抗原的特异性抗体。接着，使用ELISA或其他检测方法，定期筛查宿主动物抗血清中是否存在目标抗体。一旦检测到抗体，便移除宿主动物的脾脏，因为脾脏中含有B细胞。如果将脾脏中的所有B细胞分离出来，其中应包含一群能够分泌针对目标抗原抗体的细胞。我们将这群细胞称为多克隆，因为每个细胞可能结合了抗原上不同的表位，因而各自生成了独特且不同的抗体。

为了制备单克隆抗体（即针对单一特定表位的抗体），必须首先分离并培养产生目标抗体的单个B细胞。然而，B细胞在体外培养条件下难以长期存活。为克服这一难题，科学家将B细胞与永生化的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。随后，将这些细胞培养于选择性培养基中，该培养基仅允许杂交瘤细胞生长并分泌抗体。接着，使用ELISA等方法对培养基进行筛选，以检测是否存在目标抗体。一旦检测到阳性信号，便通过“有限稀释法”对杂交瘤细胞进行克隆，即对亲代细胞进行连续稀释，使单个细胞被分配至筛选板的各个孔中。这种方法可确保每个克隆来源于单一亲代细胞，从而获得仅分泌目标抗体的单克隆细胞系。这些单克隆细胞系可在组织培养瓶中扩增，以大量生产单克隆抗体。随后，当细胞逐渐死亡时，可使用硫酸铵从培养基中沉淀抗体。通常情况下，抗体在溶液中通过亲水相互作用与水分子结合而保持溶解状态。然而，铵离子和硫酸根离子带有高电荷，能够破坏抗体周围的水分子层，降低抗体的溶解度，从而使其发生沉淀。

首先，检查材料清单，并为本实验方案准备好所有培养基、耗材和工作台面。

然后，打开水浴锅并将其温度设置为 37 摄氏度。接下来，向一个 15 毫升的锥形管中加入 10 毫升完全 RPMI 培养基，向一个 T75 细胞培养瓶中加入 15 毫升完全 RPMI 培养基，并将其放置一旁备用。小心操作并穿戴适当的个人防护装备，从液氮储存罐中取出含有杂交瘤细胞的冻存管。为释放管内压力，可将管盖略微松开。现在，将冻存管小心地放入水浴锅中孵育，确保管盖始终位于水面以上，以尽量减少污染风险。当细胞即将完全解冻时（通常约需两分钟），立即将冻存管转移至组织培养超净台中。

然后，在打开瓶盖前，用70%乙醇擦拭小瓶外壁。使用无菌移液管将细胞转移至含有10毫升完全RPMI培养基的锥形管中。随后，以1200 RPM离心5分钟。离心后，将管子放回生物安全柜中，并用乙醇擦拭管子外壁。在不扰动细胞沉淀的前提下，弃去上清液，然后加入5毫升新鲜的完全RPMI培养基，轻轻吹打混匀以重悬细胞。接着，将细胞转移至T75细胞培养瓶中，并将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱内。让细胞生长至约80%汇合度，通常需要三天左右。请注意，杂交瘤细胞为非贴壁细胞，将在培养基中悬浮生长。达到足够汇合度所需的时间可能因起始活细胞数量及所用杂交瘤细胞类型的不同而有所差异。

当细胞生长至足够汇合时，使用无菌的25毫升移液管将细胞从培养瓶转移至锥形离心管中。在1200转/分钟下离心5分钟，使细胞沉淀。离心过程中，向三个新的T75细胞培养瓶中各加入18毫升完全RPMI培养基，并放置一旁备用。离心结束后，弃去上清液，用6毫升完全RPMI培养基轻柔重悬细胞沉淀。随后，将2毫升细胞悬液分别加入三个新的细胞培养瓶中。最后，将培养瓶置于含5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中培养，直至细胞汇合度达到约80%，大约需要三天时间。

此时，细胞已准备好在专为杂交瘤细胞系设计的无血清培养基中继续生长，例如市售的含有HB101添加剂的HB基础液体培养基。将每个细胞培养瓶中的细胞转移至锥形离心管中，然后在1200转/分钟下离心5分钟，使细胞沉淀。现在，向六个225平方厘米的细胞培养瓶中各加入230毫升含HB101添加剂的无血清培养基，并暂时放置一旁。离心完成后，弃去上清液，将每个沉淀用10毫升含HB101添加剂的培养基重悬。然后，向每个细胞培养瓶中加入5毫升细胞悬液。将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，继续培养约三周。在此期间，细胞将产生并释放目标单克隆抗体至培养基中，当细胞开始死亡时，抗体即可用于纯化。

为了从含抗体的培养基中去除细胞碎片，将培养瓶中的内容物倒入用于固定角转子的离心管中。将离心管放入转子，并确保在离心前已正确平衡。以 10,000 RPM 的速度离心八分钟。在样品离心的同时，将一个带有搅拌子的两升塑料烧杯放入装有冰的冰桶中，然后将冰桶置于搅拌器上。

接下来，将一个500毫升的滤器上部连接到一个一升的瓶子上。使用合适的管路将该瓶口滤器装置连接到实验室真空系统。然后，将含有抗体的上清液倒入滤器上部。离心剩余的培养基，以分离细胞碎片和含抗体的上清液。当滤器上部充满上清液时，启动真空泵。当一升收集瓶接近装满时，取下滤器上部，将过滤后的上清液倒入置于冰上的两升烧杯中。重复过滤步骤，直至所有上清液均被处理完毕。

当所有样品处理完毕后，按每升过滤上清液加入295克硫酸铵的比例称量。启动搅拌器，并在接下来的几个小时内缓慢地将硫酸铵加入上清液中。此操作可防止局部硫酸铵浓度过高，避免非目标蛋白发生沉淀。待硫酸铵完全加入后，用铝箔覆盖烧杯，连同搅拌器一起转移至4°C的冷室中，持续搅拌过夜。

第二天早晨，将含有硫酸铵的抗体溶液从两升烧杯中倒入用于固定角转子的洁净离心管中。以6500 RPM转速离心20分钟，不刹车，使抗体沉淀至管底。接着，小心使用真空抽吸去除上清液，注意不要吸起松软的沉淀物。继续使用同一组离心管，收集剩余含硫酸铵上清液中的抗体沉淀。最后一次抽吸完成后，将每份抗体沉淀重新悬浮于约一毫升的PBS中。

为了从抗体溶液中去除硫酸铵，首先为每毫升抗体溶液截取约一英寸长的透析管。接着用蒸馏水擦拭透析管，并在管的一端打结。用蒸馏水充满透析管，检查打结处是否泄漏。若数分钟后无泄漏，将管中的水倒出。

接下来，将抗体溶液用移液器加入透析管中。为了尽可能回收全部抗体，用额外的0.25毫升PBS冲洗离心管，并将冲洗液也转移至透析管中。用透析夹将透析管顶部尽可能靠近溶液处夹紧。然后，用胶带将透析管顶部固定在4升烧杯的外侧上缘，使透析管的充液部分悬垂于烧杯内部。现在，将烧杯放入4摄氏度冷室中，并置于搅拌台上。向烧杯中加满PBS，并放入一个搅拌子。让透析管及溶液在搅拌状态下过夜，约8小时。次日早晨，将烧杯中的PBS更换为新鲜PBS，继续搅拌约8小时。当天晚上稍后，再重复此过程一次。次日早晨，打开透析管，将抗体溶液从透析管转移至15毫升锥形管中。为去除透析过程中可能形成的任何沉淀物，将锥形管在1200转/分钟下离心5分钟。最后，将上清液转移至新的干净管中。

为定量抗体浓度，首先进行20倍稀释，将5微升抗体分装液加入95微升磷酸盐缓冲液（PBS）中。然后，用移液器将稀释后的抗体转移至比色皿中，并使用分光光度计在280纳米处读取浓度值。接下来，使用所示公式计算抗体浓度。最后，用抗体名称、浓度、制备日期以及（如适用）批次号和实验人员姓名标记螺旋盖小瓶，然后将抗体分装至已标记的螺旋盖小瓶中。分装后的抗体可于-80摄氏度保存，直至使用。

使用120G8抗小鼠CD317或PDCA-1杂交瘤细胞系的示例产量在44至99.6毫克之间，通常平均产量为67.3毫克。需要注意的是，即使使用相同的杂交瘤细胞系，每次生产批次最终获得的单克隆抗体数量可能会略有差异。