5.6: 抗体生成:使用杂交瘤生产单克隆抗体

注意:在以无菌方式处理混合瘤细胞和介质时（例如，在生物安全柜中），在抗体净化步骤之前，应保持无菌细胞培养技术。

1. 解冻冷冻杂交细胞

1. 在37°C水浴中孵育含有冷冻杂交瘤细胞的瓶，直到刚解冻（约2分钟）。
2. 将解冻细胞加入含有10 mL完整RPMI（RPMI补充10%胎儿牛血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链霉素、1mM丙酸钠、1x非必需氨基酸、50μM 2-Mercaptoto酸、10mM HEPES）的15mL锥形管中。
3. 在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以洗掉任何污染冷冻介质。
4. 离心后，丢弃液体上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在5 mL新鲜完整的RPMI中。然后，将细胞添加到含有15 mL完整RPMI（RPMI最终体积为20 mL）的T75组织培养瓶中。
5. 在37°C的标准培养箱中生长_细胞，CO2为5%。在培养中，细胞是非粘附的。

2. 杂交瘤扩张

1. 让细胞膨胀约3天，直到烧瓶是+80%的汇入。
   注意:此时间量可能因细胞的起始数量以及不同细胞的生长速率的固有差异而异。细胞处于指数生长阶段非常重要。
2. 一旦初始烧瓶达到+80%的汇合，从初始T75烧瓶中取出细胞，放入圆锥形离心管中，旋转（1200 RPM，5分钟）以颗粒细胞。
3. 将细胞悬浮在6 mL的完整RPMI中，然后将细胞悬浮液分配到三个新的T75瓶（2 mL/烧瓶，含有18 mL RPMI）。在 37°C 下用 5% CO₂孵育这三个 T75 烧瓶，直到它们发生 ±80% 的汇合（这大约需要 3 天）。

3. 无血清介质中的抗体生产

注意:此时，细胞准备在专为杂交瘤细胞系生长而设计的无血清培养基中继续生长。在此协议中，我们使用含有 HB101 补充剂产品的即用型、商用 HB 基础液体介质。

1. 三个 T75 烧瓶中的每个细胞（在 ±80% 汇合时）被收集并离心（1200 RPM，5 分钟）。
2. 每个T75瓶中的细胞颗粒被重新悬浮在10 mL补充的HB101无血清培养基中，然后加入两个T225烧瓶补充HB101无血清介质（即5 mL细胞悬浮液，每个瓶中每个瓶中含有+220-240 mL HB101）。
3. 在 37°C 的 T225 烧瓶和 HB101 介质中继续生长，在 5% CO₂下生长三周，或直到细胞开始死亡。细胞在这3周内产生mAb，并将其分泌到培养基中。一旦细胞开始死亡，它们就不再产生任何mAb。

4. 抗体纯化 - 第1天

注意:此时，不需要保持无菌，因此无需以无菌方式处理介质（例如，在生物安全柜中）。此外，杂交瘤不被视为"BSL2级"代理。

1. 将烧瓶中的介质倒入管中，用于固定角度转子。在10，000RPM的固定角度转子的离心机中旋转管子8分钟。此步骤旨在从培养液上清液中清除细胞碎片。
   注意:管尺寸可能因使用的转子而异。要记住的重要的事情是，在管中具有相同的体积，以确保转子在离心前得到适当的平衡。介质的整个体积可能一次无法放入离心机中。其余介质稍后将使用相同的管离心（步骤 4.5）。
2. 在被冰包围的桶中，用搅拌棒准备一个 2L 塑料烧杯。放在搅拌盘上。
3. 在 1L 瓶上安装 500 mL 的过滤器顶部。通过适当的管道将瓶顶过滤单元连接到室内真空。
4. 将步骤 4.1 中的上清液（仍包含杂交细胞产生的 mAb）倒入过滤器顶部。
5. 继续使用同一组管从介质中颗粒细胞碎片（颗粒将继续生成）。等待运行真空，直到过滤器顶部已满，另一批上清液准备倒入。不要让过滤器变干或过滤会变得很慢。
6. 当 1L 瓶接近满时，取出滤芯顶部并将上清液倒入步骤 4.2 中准备的 2L 烧杯中。重新连接过滤器顶部。跟踪卷。
7. 重复离心和过滤步骤，直到处理所有介质。
8. 每收集1L过滤上清液，可测量出295克硫酸铵。搅拌时，在接下来的几个小时内（每15分钟约25克）缓慢地将硫酸铵加入上清液中，以防止硫酸铵盐的局部高浓度，可能导致不需要的蛋白质沉淀。
9. 加入所有硫酸铵后，用铝箔盖住烧杯，用搅拌板移动到 4°C（例如，步入式冰箱或冷藏室）。搅拌过夜。溶液的不断搅拌需要使盐溶解，但长时间的搅拌会导致溶液中蛋白质在表面/空气界面上的变性。
10. 使用固定角度转子清洗管。

5. 抗体纯化 - 第2天

1. 将含有上清液的硫酸铵从 2L 烧杯倒入管中，用于固定角度转子。在离心机中旋转，在6500RPM下固定角度转子，无需制动，旋转20分钟。
2. 真空吸出上清液，注意不要吸起颗粒，因为它将是软的。继续使用同一组管子从含有上清液的硫酸铵中收集颗粒。
3. 在最后一次吸入后，将每个颗粒（含有抗体）重新悬浮在+1 ml PBS中。
4. 通过对大量PBS的透析，从沉淀的mAb溶液中去除硫酸铵。为此，首先为 mAb 溶液的每个 mL 切割大约 1 英寸的透析管（例如，Membra-Cel MD25-14 MWCO 12，000-14，000 道尔顿切断纤维素透析管）。用 dH₂O 将管子与管子的一端打结，然后用 dH₂O 填充，以检查该结是否泄漏。从管中清空 dH₂O。
5. 移液器 PBS/抗体溶液进入管材。用额外的 0.25 ml PBS 冲洗管，然后转移到管中。
6. 使用橙色透析夹将管的顶部固定在尽可能靠近溶液的地方。
7. 将油管顶部贴在 4L 烧杯的外顶部。让油管的填充部分悬挂到烧杯中。用 PBS 填充烧杯，并添加搅拌棒。
8. 在4°C下搅拌8小时。
9. 用新鲜的 PBS 更换烧杯中的 PBS，再搅拌 8 小时。
10. 将抗体从管转移到15或50毫升锥形管。在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以清除可能形成的任何沉淀物。将上清液转移到新鲜的管子上。
11. 用PBS（5μl抗体+ 95μlPBS）稀释抗体的等分1:20。用分光光度计（带PBS的空头）在280nm处定量抗体浓度。使用消光系数 （+） 1.43。浓度计算为
    
    
12. 将抗体与螺钉盖小瓶进行比对，并储存在 -80°C。

抗体是研究和诊断的强大工具，这意味着通常需要大量生产抗体。

生成抗体的第一步是将目标抗原注射到宿主动物体内。抗原激活宿主的 B 细胞，然后产生并释放对该抗原具有特异性的抗体。然后，使用 ELISA 或其他检测方法定期筛查宿主动物的抗血清中是否存在靶抗体。一旦检测到，宿主动物的脾脏（含有 B 细胞）就会被切除。如果现在分离出来自脾脏的所有 B 细胞，这应该包括一个分泌针对目标抗原抗体的群体。我们将这个群体称为多克隆抗体，因为每个细胞都可能与抗原的不同表位结合，因此会产生自己独特的抗体。

为了生成单克隆抗体，即为识别一个特定表位而产生的抗体，必须首先分离和培养产生所需抗体的单个 B 细胞。不幸的是，B 细胞在培养物中存活不佳。因此，为了克服这一障碍，科学家们将 B 细胞与永生骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤。然后，这些细胞在仅允许杂交瘤生长和释放抗体的选择性培养基中生长。同样，使用 ELISA 等方法筛选培养基以获得所需的抗体。一旦检测到，杂交瘤就会通过称为有限稀释的过程进行克隆，即对亲本培养物进行连续稀释，这应导致将单个细胞接种到筛选板的孔中。这允许从单个亲本细胞生长杂交瘤，产生仅释放所需抗体的单克隆细胞系。这些单克隆细胞系可以在组织培养瓶中扩增，以产生大量单克隆抗体。在此之后，随着细胞开始死亡，可以用硫酸铵从培养基中沉淀抗体。通常，在溶液中，抗体通过亲水相互作用与水相互作用。然而，铵和硫酸盐是高电荷离子，可将水分子与抗体分离，从而降低抗体的溶解度并导致它们沉淀。

首先，首先检查材料清单并为实验方案准备所有介质、耗材和工作台面。

然后，打开水浴并将其设置为 37 摄氏度。接下来，将 10 毫升完全 RPMI 加入 15 毫升锥形管中，将 15 毫升完全 RPMI 加入 T75 细胞培养瓶中，并放在一边。小心使用并穿戴适当的个人防护设备，从液氮储存中取出含有杂交瘤细胞的冷冻小瓶。要释放样品瓶内的压力，请稍微松开瓶盖。现在，小心地将样品瓶放入水浴中孵育，确保瓶盖保持在水面以上，以尽量减少污染的机会。当细胞几乎解冻时（通常需要大约两分钟），将样品瓶移至组织培养罩中。

然后，在取下瓶盖之前，用 70% 乙醇擦拭样品瓶的外部。使用无菌移液器，将细胞转移到含有 10 毫升 RPMI 完全培养基的锥形管中。然后，以 1200 RPM 的速度离心试管 5 分钟。离心后，将试管移回组织罩，并用乙醇擦拭试管外部。在不干扰沉淀的情况下，弃去上清液，然后加入 5 毫升新鲜的完全 RPMI 培养基，轻轻上下移液以重悬。接下来，将细胞转移到 T75 细胞培养瓶中，并将培养瓶放入 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中。让细胞达到大约 80% 的汇合度，这通常需要大约三天。请注意，杂交瘤细胞是非贴壁的，会在培养基中悬浮生长。达到足够汇合度的时间可能因活细胞的起始数量和所使用的杂交瘤细胞类型而异。

细胞充分汇合后，使用无菌 25 毫升移液器将它们从培养瓶转移到锥形离心管中。以 1200 RPM 离心 5 分钟，使细胞沉淀。当细胞在离心机中时，将 18 mL 完全 RPMI 添加到三个新的 T75 细胞培养瓶中，并将其放在一边。离心后，去除上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于 6 mL 完全 RPMI 中。接下来，将 2 毫升细胞悬液添加到三个新细胞培养瓶中。最后，将培养瓶放入二氧化碳浓度为 5% 且温度为 37 摄氏度的培养箱中，孵育至培养瓶汇合度约为 80%，大约需要三天。

此时，细胞已准备好在专为杂交瘤细胞系设计的无血清培养基中继续生长，例如含有 HB101 补充剂的市售 HB 基础液体培养基。将细胞从每个细胞培养瓶转移到锥形离心管中，然后以 1200 RPM 离心 5 分钟使细胞沉淀。现在，将 230 mL 补充的 HB101 无血清培养基加入 6 个 225 cm² ² 的细胞培养瓶中，并放在一边。离心完成后，去除上清液，将每个沉淀重悬于 10 毫升补充的 HB101 培养基中。然后，在每个细胞培养瓶中加入 5 mL 细胞悬液。将培养瓶放入 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中，继续培养细胞约三周。在此期间，细胞将产生目标单克隆抗体并将其释放到培养基中，当细胞开始死亡时，抗体将准备好进行纯化。

要从含抗体的培养基中去除细胞碎片，请将培养瓶的内容物倒入固定角转子的试管中。将试管放入转子中，并确保离心前其正确平衡。以 10,000 RPM 的速度离心试管 8 分钟。离心样品时，将带有搅拌棒的 2 升塑料烧杯放入冰桶中，然后将冰桶放在搅拌板上。

接下来，将 500 毫升过滤器顶部连接到 1 升瓶子上。使用适当的管道将此瓶顶过滤器装置连接到室内真空吸尘器上。然后，将含有抗体的上清液倒入过滤器顶部。离心剩余的培养基，将细胞碎片与含抗体的上清液分离。当过滤器顶部充满上清液时，启动真空。然后，当 1 升收集瓶接近满时，取下过滤器顶部，将过滤后的上清液倒入加冰的 2 升烧杯中。重复过滤步骤，直到处理完所有上清液。

处理完所有样品后，称取每 1 升过滤上清液 295 克硫酸铵。启动搅拌板，在接下来的几个小时内慢慢将硫酸铵添加到上清液中。这可以防止局部高浓度硫酸铵盐，这可能会导致不需要的蛋白质沉淀。添加完所有硫酸铵后，用箔纸盖住烧杯，将其与搅拌板一起移至 4 摄氏度的冷藏室中，并设置以搅拌抗体溶液过夜。

第二天早上，将含硫酸铵的抗体溶液从 2 升烧杯倒入固定角转子的干净试管中。将试管以 6500 RPM 离心 20 分钟，不要破裂，使抗体沉淀在试管底部。接下来，真空吸出上清液，小心不要吸走软沉淀。继续使用同一组试管从剩余的含硫酸铵上清液中收集沉淀抗体。最后一次抽吸后，将每个抗体沉淀重新悬浮在大约 1 mL 的 PBS 中。

要从抗体溶液中去除硫酸铵，首先为每毫升抗体溶液切开大约 1 英寸的透析管。接下来，用蒸馏水擦拭管路，并在管路的一端打一个结。用蒸馏水填充管路，以检查结是否泄漏。如果几分钟后没有泄漏，请将水从管道中排空。

接下来，将抗体溶液移液到管中。为了回收尽可能多的抗体，请再用 0.25 mL PBS 冲洗试管，并将其也转移到试管中。用透析夹将管子顶部尽可能靠近溶液固定。然后，将管路顶部用胶带粘在 4 升烧杯的外侧顶部，将管路的装满部分挂在烧杯中。现在，将烧杯带到 4 摄氏度的冷藏室中，并将其放在搅拌板上。用 PBS 将烧杯装满至顶部，并加入搅拌棒。让试管和溶液搅拌过夜约 8 小时。第二天早上，用新鲜的 PBS 替换烧杯中的 PBS，然后让烧杯再次搅拌约 8 小时。那天晚上晚些时候，最后一次重复这个过程。早上，打开透析管，然后将抗体溶液从透析管转移到 15 mL 锥形管中。为了去除透析过程中可能形成的任何沉淀物，以 1200 RPM 的速度离心试管 5 分钟。最后，将上清液转移到新试管中。

为了定量抗体浓度，首先将 5 μL 抗体等分试样添加到 95 μL PBS 中，进行 20 倍稀释。然后，将稀释的抗体移液到比色皿中，并使用分光光度计记录 280 纳米的浓度。接下来，使用所示公式计算抗体浓度。最后，在螺口盖样品瓶上贴上抗体名称、浓度、制备日期以及批号和实验者姓名（如适用），然后将抗体分装到标记的螺口盖样品瓶中。这些可以储存在零下 80 摄氏度，直到需要为止。

使用 120G8 抗小鼠 CD317 或 PDCA-1 杂交瘤细胞系的示例产量在 44 至 99.6 毫克之间，通常平均产量为 67.3 毫克。需要注意的是，使用同一杂交瘤细胞系进行的每次生产运行结束时可用的单克隆抗体量可能略有不同。