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Advanced Biology

收养细胞转移：将供体小鼠孢子细胞引入宿主小鼠，并通过FACS评估成功

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Immunology

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Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

5.10: Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

5.12: Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

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11:04 min

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April 30, 2023

Overview

资料来源：穆尼尔·西尔万^1，2，3，佩尔切特·蒂鲍特^1，2，3，苏菲·诺沃^4，雷切尔·戈卢布^1，2，3
¹法国巴黎巴斯德研究所免疫学系淋巴病系
² INSERM U1223，巴黎，法国
³巴黎迪德罗大学，索邦巴黎城，大提琴巴斯德，巴黎，法国
⁴流式细胞测定，细胞学和生物标志物 UtechS，转化科学中心，巴斯德研究所，法国巴黎

采用细胞转移是一种将细胞引入患者或研究生物体以治疗疾病或研究生物过程（如造血细胞）的方法。收养转让的目的多种多样;它可用于基础生物学以及医学（1，2）。在小鼠模型中，可以研究转移细胞的迁移和分布，然后跟踪系统（细胞表面标记、CFSE染色等）。在小鼠模型的癌症研究中，特定细胞群的转移可用作肿瘤的实验治疗。这项技术的另一个例子是通过将骨髓细胞转移到辐照小鼠或患有严重免疫缺陷表型的小鼠，从而产生嵌合小鼠。例如，此小鼠模型可用于评估基因删除对特定细胞群的影响。骨借用细胞的转移也用于人体医疗。当患者在癌症治疗时被照射时，骨髓的接受转移允许免疫系统重组。

此技术的第一步是获得感兴趣的细胞群。选择隔离此人群的技术取决于目标人群的特异性水平。最大的选择水平是整个器官，其中所有细胞群存在于器官。更精确的方法是选择目标细胞群，通常由一个细胞表面标记选择。在这种情况下，对单元格进行排序的理想方法是通过磁性排序。最后，最严格的级别是通过几个细胞表面标记选择细胞来对非常具体的细胞群进行排序。流式细胞分集是这种选择级别最常用的方法。一旦获得感兴趣的人口，就可以将其转移到主机。在收养转移之前，必须确保宿主和捐赠者之间的兼容性。事实上，无论转移目标如何，兼容性对于确保宿主采用细胞而不排斥细胞至关重要。

在本实验练习中，我们演示了采用细胞转移技术，方法是将CD45.2小鼠的细胞转移到CD45.1 Rag_c小鼠（缺乏淋巴细胞），四天后使用流细胞测定确认细胞转移（参见图1).

图1：收养转移的原理表。（1）从CD45.2小鼠中分离出孢子细胞，（2）在CD45.1 Rag_c小鼠中转移，仅给对照小鼠注射PBS。（3）收养转移后4天，从小鼠中恢复sssa细胞，（4）通过流动细胞学进行分析。请点击此处查看此图的较大版本。

Procedure

1. 准备

开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
消毒所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后彻底干燥。
准备 50 mL 的汉克平衡盐溶液（HBSS）含有 2% 胎儿小牛血清（FCS）。

2. 解剖

使用二氧化碳输送系统，用缺氧对小鼠实施安乐死。将安乐死小鼠固定在上部位置的解剖板上，并使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术。
使用钳子移动腹部右侧的肠道和胃，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。
使用钳子小心地从胃分离脾脏，并将其放在含有 5 mL 的 HBSS 2% FCS 的培养皿上。

3. 免疫细胞隔离

将脾脏放在培养皿上的 40 μm 细胞滤网上。用柱塞压碎脾脏以将其分离。
用 1 mL 的 HBSS 2% FCS 对柱塞和滤网进行冲毛，以恢复粘附细胞。
将分离的脾脏和液体转移到15 mL离心管中。
用 5 毫升的 HBSS 2% FCS 清洗培养皿，并将液体转移到 15 mL 管中。
在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
在 2 mL 氯化钾移液器中重新悬浮颗粒，以重新悬浮颗粒并赖解红细胞。
等待 2 分钟，并将 HBSS 2% FCS 添加到悬浮颗粒中，以获得高达 14 mL 的体积。
在 10°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，通过上下移液，将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 HBSS 2% FCS 中。
使用锥蓝色染色测定对细胞进行计数，并使用适当的HBSS 2%FCS量将最终细胞浓度调整到10⁷细胞/mL。

4. 收养转让

在 5 mL 收集管中传输 2 mL 的细胞悬浮液。
在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，然后丢弃上清液。
将颗粒重新悬浮在 2 mL 的 PBS 中，并在 370 x g下离心管，在 10°C 下 7 分钟。
在 200 μL 的 PBS 中丢弃上清液并重新悬浮颗粒。
使用带29G针头的0.5 mL注射器将200μL的细胞悬浮液静脉注射到实验小鼠的逆轨血鼻孔中。
作为对照，用200μL的磷酸盐缓冲盐水在同一血弦中注射第二只小鼠。

5. 细胞收获和染色

收养转移四天后，对小鼠实施安乐死并切除脾脏。
如第 3 节所述，收获 ssnocy 细胞。
将每只小鼠的100 μL细胞悬浮液转移到两个FACS管中，标有”控制”和”转移”。
在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，然后丢弃上生子。
在表1所列稀释液中准备含有四种抗体的混合物。

抗体	氟铬	稀释
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

表1：抗体混合组合。使用浓缩抗体荧光结合剂和HBSS制备四种抗体鸡尾酒。

将100μL的混合加入到每个管子中，然后在黑暗中在冰上孵育20分钟。
加入 1 mL 的 HBSS 2%FCS，然后在 370 x g 下在 10°C 下将管离心 3 分钟。
丢弃上生子，在 200 μL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。
将重新悬浮的细胞转移到新的、标有 FACS 的管中。
使用流细胞测定法（如FACS协议所示）评估CD45.2阳性淋巴细胞的存在。

6. 数据分析

打开”FlowJo”软件，在”所有样本”窗口中拖动每个管的文件。
双击”传输”文件，在 Y 轴上显示正向散射”SSC-A”的点图上显示从该样本记录的单元格，在 X 轴上显示侧散射”FSC-A”。
点击”多边形”并创建一个门控策略来选择淋巴细胞，然后使用细胞表面标记（CD45.1，CD45.2）区分供体和宿主细胞，然后表征CD45.2⁺细胞群（CD3，CD4）。
使用”控制鼠标”文件重复分析步骤。
要可视化单元格填充，请单击”布局编辑器”。
将”转移的单元格”和”转移的CD4 单元格”从”传输”和”控制”文件拖到”布局编辑器选项卡”中。
将显示表示 CD45.2⁺细胞和 CD4 淋巴细胞的点图。
CD45.2 传输的细胞应只出现在”转移鼠标”点图中。

采用细胞转移是一种将感兴趣的细胞引入生物体的方法。它是研究各种生物机制的有力技术，包括免疫细胞特定类别的作用。此外，收养转移是一种有前途的新疗法，适用于许多疾病，例如那些需要骨髓移植或癌症治疗的患者自己的T细胞可以提取，改变，以识别和摧毁癌细胞，以及然后回到身体来对抗肿瘤。

在实验室里，动物模型经常被用来研究收养转移。例如，CD45.1 Rag Gamma-c 敲除小鼠缺乏许多细胞因子的基本受体，这是造血干细胞正常分化为淋巴细胞所必需的。因此，敲除小鼠的淋巴细胞发育受损，没有自然杀伤剂，或NK，细胞，T细胞，或B细胞。

通过首先收获含有高浓度免疫细胞（如脾脏）的供体小鼠组织，收养转移可用于将缺失的免疫细胞引入这些受损的小鼠体内。然后组织分离，各种脾细胞，包括免疫细胞，被分离。其次，不需要的红细胞，或红血球，可以通过添加氯化铵钾解毒缓冲液进行解液，剩余的白细胞，或血细胞，然后使用离心从细胞碎片中分离出来。

最后，将纯化的小鼠注射到免疫功能低下小鼠中，促进对这些细胞功能的详细研究。几天后，通过首先以与供体组织相同的方式分离和制备宿主脾细胞，可以确认收养免疫细胞转移的成功。然后，这些细胞使用标记抗体对供体免疫细胞标记进行染色，以便使用 FACS 验证和分类它们。

首先，戴上实验室手套和适当的防护设备。接下来，先用洗涤剂洗一把钳子，然后用70%的乙醇清洗剪刀，然后用干净的纸巾擦干。将一毫升FCS与49毫升的HBSS在50毫升管中结合，用2%的胎儿小牛血清（FCS）制备50毫升汉克平衡盐溶液（HBSS）。通过轻轻上下移液约10次混合。

解剖小鼠并切除其脾脏，如用于脾B淋巴细胞分离的JoVE视频协议FACS技术所示。要分离免疫细胞，首先将脾脏放在培养皿中的40微米细胞过滤器上。用柱塞压碎脾脏，将其分离到盘子里。用 1 毫升的 HBSS 2% FCS 对柱塞和滤网进行冲剂，以恢复粘附细胞。然后，将分离的脾脏和液体从培养皿移入50毫升的离心管中。用 5 毫升的 HBSS 2% FCS 清洗培养皿，并将液体转移到 15 毫升管中。

在 370 次 g 下在 10 摄氏度下将管离心 7 分钟，然后小心取回管，以免干扰颗粒。现在，在不干扰颗粒的情况下去除上清液，并将液体丢弃在适当的废物容器中。然后，在离心管中加入两毫升氯化铵酸钾解毒缓冲液，上下移液器重新悬浮颗粒并赖解红细胞。等待两分钟，然后将 HBSS 2% FCS 添加到悬浮颗粒中，以获得 14 毫升的总价值。重复离心。小心取回管子并丢弃上清液。然后，通过上下移液，将颗粒重新悬浮在 5 毫升 HBSS 2% FCS 中。接下来，计算悬浮细胞的数量。将五微升的试青加入五微升的细胞悬浮液，并通过移液很好地混合。然后，轻轻地在盖玻璃和马拉塞兹幻灯片之间沉积五微升的稀释细胞悬浮液。将显微镜设置为 40 倍放大倍率时，计算细胞数。通过添加适当的HBSS 2%FCS，将细胞浓度调整到每毫升10至7个细胞。

要开始收养转移，将两毫升的细胞悬浮液转移到五毫升收集管。在370次g下在10摄氏度下将管子离心7分钟，然后丢弃上清液。接下来，将颗粒重新悬浮在两毫升磷酸盐缓冲盐水中，并在10摄氏度的温度下将管在370次g下离心7分钟。丢弃上清液。然后，在200微升磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮颗粒。使用带有29口径针头的0.5毫升注射器，将200微升的细胞悬浮液静脉注射到实验小鼠的逆轨血坏液中。

收养转移四天后，对小鼠实施安乐死并切除脾脏。然后，如第三节所述，收获免疫细胞。接下来，将每只小鼠的100微升细胞悬浮液转移到两个贴有控制标签的FACS管中并转移。在370次g下在10摄氏度下将管子离心7分钟，然后丢弃上生子。现在，在表一所列稀释剂处准备一个含有四种抗体的混合物。将100微升的混合物加入每根管子，然后在黑暗中在冰上孵育20分钟。接下来，在每个管中加入一毫升HBSS 2%FCS，然后在10摄氏度的温度下以370次g将管离心3分钟。丢弃上生子，然后在 200 微升的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。将重新悬浮的细胞转移到新的标记的 FACS 管中。现在，使用 FACS 协议中所示的流式细胞测定法来评估 CD45 的存在。2阳性淋巴细胞。

现在，我们将确定从 CD45 中分离出的 CD45.2 淋巴细胞的存在。1 主脾脏。要开始，双击 FlowJo 图标，并拖动所有示例窗口中每个管的文件。然后，双击传输的文件，在点图上显示从该样本记录的单元格，该点图在 x 轴上显示向前散射 FSCA，在 y 轴上显示侧散射 SSCA。单击多边形以圈出淋巴细胞群。将显示一个新的子填充标识窗口。单击”确定”。现在，将 y 轴设置为 FSC-W，将 x 轴设置为 FSC-A。选择使用多边形工具的单个单元格填充，如前面所示。

接下来，双击圈填充，为所选单元格创建一个新窗口。在新窗口中，在 X 上的 Y 和 CD45.1 上选择 CD45.2。单击 T 图标并自定义轴以放大绘图。接下来，单击多边形以圈出 CD45.2 正细胞。在子填充标识窗口中，命名单元格群转移的单元格，然后单击”确定”。在同一窗口中，单击矩形以选择 CD45.2 负单元格。在子填充标识窗口中，命名单元格填充宿主单元格，然后单击”确定”。接下来，双击 CD45.2 圈填充、转移总体，为所选单元格创建一个新窗口。在新窗口中，选择 X 上的 Y 和 CD4 上的 CD3。

接下来，单击多边形以圈出 CD4 CD3 阳性细胞。在此子填充标识窗口中，命名已转移的细胞群 CD4 细胞。然后，使用控制鼠标文件重复前面的分析步骤。最后，要可视化单元格群，请单击布局编辑器。将传输的单元格和传输的 CD4 单元格从传输和控制文件拖动到布局编辑器选项卡中。将显示一个点图，表示 CD45.2 阳性细胞和 CD4 淋巴细胞。CD45.2 传输的单元格应仅出现在传输的鼠标点图中。

Results

拉加克小鼠的免疫系统组成发生了变化，主要缺乏淋巴细胞。Ssacy细胞的接受转移允许引入缺乏的种群，如T和B细胞。我们的染色包括细胞表面标记CD45.1和CD45.2分别区分宿主细胞和供体细胞（图2A）。它还包括其他细胞表面标记，以突出拉格奇小鼠中不存在的细胞群，如CD4 T细胞（图2B）。如预期的那样，控制小鼠没有CD45.2阳性细胞（图2B，顶部面板）和转移鼠标（图2B，底部面板，占细胞总数的71.2%）。我们还可以专门检测转移细胞内的CD4 T细胞（CD45.2细胞的22.1%）。

图2：收养转让的代表性结果。（A）注射PBS（对照组）和注射CD45.2s细胞（测试组）（实线）的小鼠CD45.2细胞的直方图。（B）注射PBS（顶板）对照小鼠和注射CD45.2血细胞（底板）对照小鼠的CD45.2阳性细胞的注口策略。使用细胞表面标记（CD45.1，CD45.2）区分供体细胞和宿主细胞，然后CD45.2阳性细胞群特征（CD3，CD4）。请点击此处查看此图的较大版本。

Applications and Summary

收养转移是一种在不同科学领域的转化技术，在医学领域具有应用价值。该技术可用于研究特定细胞群中的细胞迁移和代谢或蛋白质缺乏发生率。在最后一种情况下，可以使用不同的技术，特别是特定细胞群内在缺陷的转基因小鼠。然而，基因结构获得转基因小鼠可能是一个非常复杂和漫长的过程。在这种情况下，缺乏细胞群的收养转移更容易和更快。

收养转移在医学上具有直接的应用。例如，在癌症治疗期间，辐照患者的骨髓移植用于重组免疫系统。最近，其他收养转移应用也被用于医疗领域。人工T细胞（称为CAR T细胞）旨在识别和消除某些癌症。此外，这些工程电池旨在降低宿主的排斥风险。CAR T细胞的转移目前正在临床试验中测试。

References

Restifo, N. P., Dudley, M. E. and Rosenberg., S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nature reviews. Immunology, 12 (4): 269-281, (2012).
Bonini, C., and Mondino, A. Adoptive T-cell therapy for cancer: The era of engineered T cells. European journal of immunology, 45 (9): 2457-69, (2015).

Transcript

Adoptive cell transfer is a method for introducing cells of interest into an organism. It is a powerful technique to study various biological mechanisms, including the action of specific classes of immune cells. In addition, adoptive transfer is a promising novel treatment for numerous conditions, such as those requiring bone marrow transplants or cancer treatments where a patient’s own T-cells can be extracted, altered to recognize and destroy the cancerous cells, and then returned to the body to fight tumors.

In the laboratory, animal models are often used to study adoptive transfer. For example, CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental receptors for many cytokines, which are essential for normal differentiation of hematopoietic stem cells into lymphocytes. As a result, the knockout mice have a compromised lymphocyte development and do not have natural killer, or NK, cells, T-cells, or B-cells.

Adoptive transfer can be used to introduce the missing immune cells into these compromised mice, by first harvesting donor mouse tissue containing high concentrations of immune cells, such as the spleen. The tissue is then dissociated and a variety of spleen cells, including the immune cells, are isolated. Next, unwanted erythrocytes, or red blood cells, can be lysed via the addition of ammonium chloride potassium lysing buffer and the remaining white blood cells, or splenocytes, are then separated from the cell debris using centrifugation.

Finally, the purified splenocytes are injected into the immunocompromised mice, facilitating detailed studies of these cells’ functions. Several days later, the success of the adoptive immune cell transfer can be confirmed by first isolating and preparing the host splenoncytes in the same manner as the donor tissue. Then, these cells are stained using labeled antibodies against the donor immune cell markers so that they can be verified and sorted using FACS.

To begin, put on laboratory gloves and the appropriate protective equipment. Next, wash a pair of forceps and dissecting scissors first with a detergent and then with 70% ethanol and then dry them with a clean paper towel. Prepare 50 milliliters of Hank’s Balanced Salt Solution, or HBSS, with 2% Fetal Calf Serum, or FCS, by combining one milliliter of FCS with 49 milliliters of HBSS in a 50 milliliter tube. Mix by gently pipetting the solution up and down approximately 10 times.

Dissect the euthanized mouse and remove its spleen as demonstrated in the JoVE video protocol FACS technology for splenic B lymphocytes separation. To isolate immune cells, first place the spleen on a 40 micrometer cell strainer in a petri dish. Crush the spleen with a plunger to dissociate it into the dish. Recover the adhered cells by rinsing the plunger and the strainer with 1 milliliter of HBSS 2% FCS. Then, pipette the dissociated spleen and fluid from the petri dish into a 50 milliliter centrifuge tube. Wash the petri dish with 5 milliliters of HBSS 2% FCS and transfer the fluid to the 15 milliliter tube.

Centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then retrieve the tube carefully so as not to disturb the pellet. Now, remove the supernatant without disturbing the pellet and discard the liquid in an appropriate waste container. Then, add two milliliters of ammonium chloride potassium lysing buffer to the centrifuge tube and pipette up and down to resuspend the pellet and lyse the erythrocytes. Wait for two minutes and then add HBSS 2% FCS to the resuspended pellet to obtain a total value of 14 milliliters. Repeat the centrifugation. Retrieve the tube carefully and discard the supernatant. Then, resuspend the pellet in 5 milliliters HBSS 2% FCS by pipetting up and down. Next, count the cells in suspension. Add five microliters of trypan blue to five microliters of cell suspension and mix well by pipetting. Then, gently deposit a five microliter drop of diluted cell suspension between the cover glass and the Malassez slide. With the microscope set to 40X magnification, count the number of cells. Adjust the cell concentration to 10 to the seven cells per milliliter by adding the appropriate volume of HBSS 2% FCS.

To begin the adoptive transfer, transfer two milliliters of the cell suspension to a five milliliter collection tube. Centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then discard the supernatant. Next, resuspend the pellet in two milliliters of phosphate buffered saline and centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant. Then, resuspend the pellet in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, inject 200 microliters of cell suspension into the experimental mouse intravenously into the retro-orbital blood sinus.

Four days after the adoptive transfer, euthanize the mice and remove the spleens. Then, harvest the immune cells as described in section three. Next, transfer 100 microliters of cell suspension from each mouse into two FACS tubes labeled control and transferred. Centrifuge the tubes at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then discard the supernatants. Now, prepare a mix containing the four antibodies at the dilution listed in table one. Add 100 microliters of the mix to each tube and then incubate for 20 minutes on ice in the dark. Next, add one milliliter of HBSS 2% FCS to each tube and then centrifuge the tubes at 370 times g for three minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants and then resuspend the pellets in 200 microliters of HBSS 2% FCS. Transfer the resuspended cells to new labeled FACS tubes. Now, use flow cytometry as shown in the FACS protocol to evaluate the presence of CD45. 2 positive lymphocytes.

Now, we will determine the presence CD45.2 lymphocytes that were isolated from the CD45. 1 host spleen. To start, double click on the FlowJo icon and drag the files for each tube in the all sample window. Then, double click on the transferred file to display the cells recorded from that sample on a dot plot that displays forward scatter FSCA on the x-axis and side scatter SSCA on the y-axis. Click on polygon to circle the lymphocyte populations. A new subpopulation identification window appears. Click on OK. Now, set the y-axis to FSC-W and the x-axis to FSC-A. Select the single cell population with the polygon tool as previously demonstrated.

Next, double click on the circled population to create a new window for the selected cells. In the new window, select CD45.2 on the Y and CD45.1 on the X. Click on the T icon and customize the axis to enlarge the plot. Next, click on polygon to circle the CD45.2 positive cells. In the subpopulation identification window, name your cell population transferred cells and click OK. In the same window, click on rectangle to select the CD45.2 negative cells. In the subpopulation identification window, name your cell population host cells and click OK. Next, double click on the CD45.2 circled population, transferred population, to create a new window for the selected cells. In the new window, select CD3 on the Y and CD4 on the X.

Next, click on polygon to circle the CD4 CD3 positive cells. In this subpopulation identification window, name your cell population transferred CD4 cells. Then, repeat the previous analysis steps with the control mouse file. Finally, to visualize your cell populations, click on Layout Editor. Drag the transferred cells and the transferred CD4 cells population from transferred and control files into the Layout Editor tab. A dot plot representing CD45.2 positive cells and CD4 lymphocytes will appear. CD45. 2 transferred cells should only appear in the transferred mouse dot plot.

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