过继性细胞转移：将供体小鼠脾细胞导入受体小鼠并通过流式细胞术评估转移效果

1. 准备

1. 开始前，戴上实验室手套并穿上适当的防护服。
2. 先用洗涤剂，再用70%乙醇对所有解剖工具进行灭菌，然后彻底干燥。
3. 准备含有2%胎牛血清（FCS）的50 mL Hank平衡盐溶液（HBSS）。

2. 解剖

1. 使用二氧化碳输送系统，通过缺氧法处死小鼠。将已处死的小鼠仰卧固定于解剖板上，用剪刀和镊子进行纵向腹腔切开。
2. 用镊子将肠道和胃向腹部右侧移动，以暴露胃和脾脏。脾脏与胃相连。
3. 用镊子小心地将脾脏从胃上分离，并将其置于含有 5 mL HBSS 2% FCS 的培养皿中。

3. 免疫细胞分离

1. 将脾脏置于培养皿上方的40 µm细胞筛网上，用注射器活塞压碎脾脏以进行解离。
2. 用1 mL含2% FCS的HBSS冲洗活塞和细胞筛网，回收粘附的细胞。
3. 将解离后的脾脏组织和液体转移至15 mL离心管中。
4. 用5 mL含2% FCS的HBSS冲洗培养皿，并将冲洗液转移至15 mL离心管中。
5. 在10°C条件下以370 × g离心7分钟，弃去上清液，注意保留沉淀。
6. 在沉淀中加入2 mL氯化铵钾溶液，反复吹打重悬沉淀，以裂解红细胞。
7. 静置2分钟后，加入含2% FCS的HBSS至终体积为14 mL。
8. 再次在10°C条件下以370 × g离心7分钟，弃去上清液，用5 mL含2% FCS的HBSS通过反复吹打重悬沉淀。
9. 使用台盼蓝染色法计数细胞，并用适量体积的含2% FCS的HBSS调整细胞浓度至10⁷个细胞/mL。

4. 过继性转移

1. 将获得的细胞悬液转移2 mL至5 mL收集管中。
2. 在10°C条件下，以370 × g 离心7分钟，然后弃去上清液。
3. 将沉淀用2 mL PBS重悬，再在10°C条件下，以370 × g 离心7分钟。
4. 弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL PBS中。
5. 使用带有29G针头的0.5 mL注射器，将200 µL细胞悬液经眼后静脉窦注射至实验小鼠体内。
6. 作为对照，向第二只小鼠的同一静脉窦注射200 µL磷酸盐缓冲液。

5. 细胞收获与染色

1. 过继转移后第四天，处死小鼠并取出脾脏。
2. 按照第3节所述方法分离脾细胞。
3. 从每只小鼠中取100 µL细胞悬液，分别加入两个已标记为"对照"和"转移"的FACS管中。
4. 在10°C下以370 × g 离心7分钟，然后弃去上清液。
5. 配制含有四种抗体的混合液，抗体稀释比例见表1。

抗体	荧光染料	稀释比例
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

表1：抗体混合物组成。 使用浓缩的抗体-荧光偶联物和HBSS配制四种抗体鸡尾酒。

6. 向每管中加入 100 µL 混合液，然后在冰上避光孵育 20 分钟。
7. 加入 1 mL HBSS 2%FCS，然后在 10°C 下以 370 × g 离心 3 分钟。
8. 弃去上清液，将沉淀物重悬于 200 µL HBSS 2% FCS 中。
9. 将重悬的细胞转移至新的、已标记的 FACS 管中。
10. 使用流式细胞术，按照 FACS 方案所示，检测 CD45.2 阳性淋巴细胞的存在情况。

6. 数据分析

1. 打开 "FlowJo" 软件，将每个样品管的文件拖入 "所有样品" 窗口中。
2. 双击 "转移样品" 文件，以在点图上显示该样品中记录的细胞，其中纵轴为侧向散射 "SSC-A"，横轴为前向散射 "FSC-A"。
3. 点击 "多边形" 工具，建立设门策略以选择淋巴细胞，然后利用细胞表面标志物（CD45.1、CD45.2）区分供体与宿主细胞，再进一步分析 CD45.2⁺ 细胞群体（CD3、CD4）。
4. 使用 "对照小鼠" 文件重复上述分析步骤。
5. 要可视化某一细胞群体，点击 "布局编辑器"。
6. 将来自 "转移样品" 和 "转移的CD4细胞" 群体的 "转移样品" 与 "对照" 文件拖入 "布局编辑器标签页" 中。
7. 将出现一个点图，显示 CD45.2⁺ 细胞和 CD4 淋巴细胞。
8. CD45.2 标记的转移细胞应仅出现在 "转移小鼠" 的点图中。