5.11: 收养细胞转移:将供体小鼠孢子细胞引入宿主小鼠，并通过FACS评估成功

1. 准备

1. 开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
2. 消毒所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后彻底干燥。
3. 准备 50 mL 的汉克平衡盐溶液 （HBSS） 含有 2% 胎儿小牛血清 （FCS）。

2. 解剖

1. 使用二氧化碳输送系统，用缺氧对小鼠实施安乐死。将安乐死小鼠固定在上部位置的解剖板上，并使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术。
2. 使用钳子移动腹部右侧的肠道和胃，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。
3. 使用钳子小心地从胃分离脾脏，并将其放在含有 5 mL 的 HBSS 2% FCS 的培养皿上。

3. 免疫细胞隔离

1. 将脾脏放在培养皿上的 40 μm 细胞滤网上。用柱塞压碎脾脏以将其分离。
2. 用 1 mL 的 HBSS 2% FCS 对柱塞和滤网进行冲毛，以恢复粘附细胞。
3. 将分离的脾脏和液体转移到15 mL离心管中。
4. 用 5 毫升的 HBSS 2% FCS 清洗培养皿，并将液体转移到 15 mL 管中。
5. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
6. 在 2 mL 氯化钾移液器中重新悬浮颗粒，以重新悬浮颗粒并赖解红细胞。
7. 等待 2 分钟，并将 HBSS 2% FCS 添加到悬浮颗粒中，以获得高达 14 mL 的体积。
8. 在 10°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，通过上下移液，将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 HBSS 2% FCS 中。
9. 使用锥蓝色染色测定对细胞进行计数，并使用适当的HBSS 2%FCS量将最终细胞浓度调整到10⁷细胞/mL。

4. 收养转让

1. 在 5 mL 收集管中传输 2 mL 的细胞悬浮液。
2. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，然后丢弃上清液。
3. 将颗粒重新悬浮在 2 mL 的 PBS 中，并在 370 x g下离心管，在 10°C 下 7 分钟。
4. 在 200 μL 的 PBS 中丢弃上清液并重新悬浮颗粒。
5. 使用带29G针头的0.5 mL注射器将200μL的细胞悬浮液静脉注射到实验小鼠的逆轨血鼻孔中。
6. 作为对照，用200μL的磷酸盐缓冲盐水在同一血弦中注射第二只小鼠。

5. 细胞收获和染色

1. 收养转移四天后，对小鼠实施安乐死并切除脾脏。
2. 如第 3 节所述，收获 ssnocy 细胞。
3. 将每只小鼠的100 μL细胞悬浮液转移到两个FACS管中，标有"控制"和"转移"。
4. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，然后丢弃上生子。
5. 在表1所列稀释液中准备含有四种抗体的混合物。

表1:抗体混合组合。使用浓缩抗体荧光结合剂和HBSS制备四种抗体鸡尾酒。

6. 将100μL的混合加入到每个管子中，然后在黑暗中在冰上孵育20分钟。
7. 加入 1 mL 的 HBSS 2%FCS，然后在 370 x g 下在 10°C 下将管离心 3 分钟。
8. 丢弃上生子，在 200 μL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。
9. 将重新悬浮的细胞转移到新的、标有 FACS 的管中。
10. 使用流细胞测定法（如FACS协议所示）评估CD45.2阳性淋巴细胞的存在。

6. 数据分析

1. 打开"FlowJo"软件，在"所有样本"窗口中拖动每个管的文件。
2. 双击"传输"文件，在 Y 轴上显示正向散射"SSC-A"的点图上显示从该样本记录的单元格，在 X 轴上显示侧散射"FSC-A"。
3. 点击"多边形"并创建一个门控策略来选择淋巴细胞，然后使用细胞表面标记（CD45.1，CD45.2）区分供体和宿主细胞，然后表征CD45.2⁺细胞群（CD3，CD4）。
4. 使用"控制鼠标"文件重复分析步骤。
5. 要可视化单元格填充，请单击"布局编辑器"。
6. 将"转移的单元格"和"转移的CD4 单元格"从"传输"和"控制"文件拖到"布局编辑器选项卡"中。
7. 将显示表示 CD45.2⁺细胞和 CD4 淋巴细胞的点图。
8. CD45.2 传输的细胞应只出现在"转移鼠标"点图中。

过继细胞转移是一种将目标细胞引入生物体的方法。它是研究各种生物机制的强大技术，包括特定类别的免疫细胞的作用。此外，过继转移是一种很有前途的新型治疗方法，适用于许多疾病，例如需要骨髓移植或癌症治疗的疾病，其中可以提取、改变患者自身的 T 细胞以识别和破坏癌细胞，然后返回体内对抗肿瘤。

在实验室中，动物模型通常用于研究过继转移。例如，CD45.1 Rag γ-c 敲除小鼠缺乏许多细胞因子的基本受体，而这些细胞因子对于造血干细胞正常分化为淋巴细胞至关重要。因此，敲除小鼠的淋巴细胞发育受损，没有自然杀伤细胞或 NK 细胞、T 细胞或 B 细胞。

过继转移可用于将缺失的免疫细胞引入这些受损小鼠体内，方法是首先收获含有高浓度免疫细胞（如脾脏）的供体小鼠组织。然后解离组织并分离各种脾细胞，包括免疫细胞。接下来，可以通过添加氯化铵钾裂解缓冲液来裂解不需要的红细胞或红细胞，然后通过离心将剩余的白细胞或脾细胞与细胞碎片分离。

最后，将纯化的脾细胞注射到免疫功能低下的小鼠体内，便于详细研究这些细胞的功能。几天后，可以通过首先以与供体组织相同的方式分离和制备宿主脾细胞来确认过继免疫细胞转移的成功。然后，使用针对供体免疫细胞标志物的标记抗体对这些细胞进行染色，以便可以使用 FACS 对其进行验证和分类。

首先，戴上实验室手套和适当的防护设备。接下来，先用清洁剂清洗一把镊子和解剖剪刀，然后用 70% 乙醇清洗，然后用干净的纸巾擦干。通过在 50 毫升试管中将 1 毫升 FCS 与 49 毫升 HBSS 混合，制备 50 毫升 Hank's 平衡盐溶液 （HBSS） 和 2% 胎牛血清 （FCS）。轻轻上下吹打溶液约 10 次，混匀。

解剖安乐死的小鼠并切除其脾脏，如用于脾 B 淋巴细胞分离的 JoVE 视频协议 FACS 技术所示。为了分离免疫细胞，首先将脾脏放在培养皿中的 40 微米细胞过滤器上。用柱塞压碎脾脏，使其解离到培养皿中。通过用 1 毫升 HBSS 2% FCS 冲洗柱塞和过滤器来回收粘附的细胞。然后，将分离的脾脏和液体从培养皿中移液到 50 毫升离心管中。用 5 毫升 HBSS 2% FCS 清洗培养皿，并将液体转移到 15 毫升试管中。

10 摄氏度下以 370 倍 g 离心管 7 分钟，然后小心取出管子，以免干扰沉淀。现在，在不干扰沉淀的情况下去除上清液，并将液体丢弃在适当的废物容器中。然后，向离心管中加入 2 毫升氯化铵钾裂解缓冲液，并上下移液以重悬沉淀并裂解红细胞。等待 2 分钟，然后将 HBSS 2% FCS 添加到重悬的沉淀中，得到 14 毫升的总值。重复离心。小心地取回试管并丢弃上清液。然后，通过上下吹打，将沉淀重悬于 5 毫升 HBSS 2% FCS 中。接下来，对悬浮细胞进行计数。将 5 微升台盼蓝加入 5 微升细胞悬液中，并通过移液充分混合。然后，在盖玻片和 Malassez 载玻片之间轻轻滴入一滴 5 微升稀释的细胞悬液。将显微镜设置为 40 倍放大倍率，计数细胞数。通过添加适当体积的 HBSS 2% FCS，将细胞浓度调整为每毫升 7 个细胞的 10 个。

要开始过继转移，请将 2 毫升细胞悬液转移到 5 毫升收集管中。将试管在 10 摄氏度下以 370 次 g 离心 7 分钟，然后弃去上清液。接下来，将沉淀重悬于 2 毫升磷酸盐缓冲盐水中，并在 10 摄氏度下以 370 倍 g 离心管 7 分钟。丢弃上清液。然后，将沉淀重悬于 200 μL 磷酸盐缓冲盐水中。使用带有 0.5 号针头的 29 毫升注射器，将 200 微升细胞悬液静脉注射到实验小鼠的眶后血窦中。

收养转移后 4 天，对小鼠实施安乐死并切除脾脏。然后，按照第 3 节中的说明收获免疫细胞。接下来，将每只小鼠的 100 微升细胞悬液转移到两个标记为对照和转移的 FACS 管中。将试管在 10 摄氏度下以 370 倍 g 离心 7 分钟，然后弃去上清液。现在，制备含有表 1 中所列稀释度的四种抗体的混合物。向每管中加入 100 微升混合物，然后在黑暗中在冰上孵育 20 分钟。接下来，向每个试管中加入 1 毫升 HBSS 2% FCS，然后在 10 摄氏度下以 370 倍 g 离心试管 3 分钟。弃去上清液，然后将沉淀重悬于 200 微升 HBSS 2% FCS 中。将重悬的细胞转移到新标记的 FACS 管中。现在，使用 FACS 方案中所示的流式细胞术来评估 CD45 的存在。2 个阳性淋巴细胞。

现在，我们将确定从 CD45.2 中分离的 CD45.2 淋巴细胞的存在。1 宿主脾脏。首先，双击 FlowJo 图标并在所有样品窗口中拖动每个试管的文件。然后，双击传输的文件，在点图上显示从该样品中记录的细胞，该点图在 x 轴上显示前向散射 FSCA，在 y 轴上显示侧向散射 SSCA。单击多边形以圈出淋巴细胞群。此时将显示一个新的亚群标识窗口。点击 OK（确定）。现在，将 y 轴设置为 FSC-W，将 x 轴设置为 FSC-A。如前所述，使用多边形工具选择单个细胞群。

接下来，双击带圆圈的群体，为所选单元格创建新窗口。在新窗口中，选择 Y 上的 CD45.2 和 X 上的 CD45.1。单击 T 图标并自定义轴以放大绘图。接下来，单击多边形以圈出 CD45.2 阳性细胞。在亚群识别窗口中，为您的细胞群命名转移的细胞，然后单击 OK（确定）。在同一窗口中，单击矩形以选择 CD45.2 阴性细胞。在亚群识别窗口中，为您的细胞群命名宿主细胞，然后单击 OK（确定）。接下来，双击 CD45.2 圈出的群体，转移的群体，为所选细胞创建一个新窗口。在新窗口中，选择 Y 上的 CD3 和 X 上的 CD4。

接下来，单击多边形以圈出 CD4 CD3 阳性细胞。在此亚群识别窗口中，命名您的细胞群转移的 CD4 细胞。然后，使用控制鼠标文件重复前面的分析步骤。最后，要可视化您的细胞群，请单击 Layout Editor。将转移的细胞和转移的 CD4 细胞群从转移的和控制文件拖到 Layout Editor 选项卡中。将出现代表 CD45.2 阳性细胞和 CD4 淋巴细胞的点图。CD45 的。2 个转移的细胞应仅出现在转移的鼠标点图中。