过继性细胞转移：将供体小鼠脾细胞导入受体小鼠并通过流式细胞术评估转移效果
来源：Meunier Sylvain1,2,3，Perchet Thibaut1,2,3，Sophie Novault4，Rachel Golub1,2,3
1 淋巴细胞生成研究组，免疫学系，法国巴黎巴斯德研究所
2 法国国家健康与医学研究院（INSERM）U1223，法国巴黎
3 巴黎狄德罗大学，…
1. 准备
- 开始前，戴上实验室手套并穿上适当的防护服。
- 先用洗涤剂，再用70%乙醇对所有解剖工具进行灭菌，然后彻底干燥。
- 准备含有2%胎牛血清（FCS）的50 mL Hank平衡盐溶液（HBSS）。
2. 解剖
- 使用二氧化碳输送系统，通过缺氧法处死小鼠。将已处死的小鼠仰卧固定于解剖板上，用剪刀和镊子进行纵向腹腔切开。
- 用镊子将肠道和胃向腹部右侧移动，以暴露胃和脾脏。脾脏与胃相连。
- 用镊子小心地将脾脏从胃上分离，并将其置于含有 5 mL HBSS 2% FCS 的培养皿中。
3. 免疫细胞分离
- 将脾脏置于培养皿上方的40 µm细胞筛网上，用注射器活塞压碎脾脏以进行解离。
- 用1 mL含2% FCS的HBSS冲洗活塞和细胞筛网，回收粘附的细胞。
- 将解离后的脾脏组织和液体转移至15 mL离心管中。
- 用5 mL含2% FCS的HBSS冲洗培养皿，并将冲洗液转移至15 mL离心管中。
- 在10°C条件下以370 × g离心7分钟，弃去上清液，注意保留沉淀。
- 在沉淀中加入2 mL氯化铵钾溶液，反复吹打重悬沉淀，以裂解红细胞。
- 静置2分钟后，加入含2% FCS的HBSS至终体积为14 mL。
- 再次在10°C条件下以370 × g离心7分钟，弃去上清液，用5 mL含2% FCS的HBSS通过反复吹打重悬沉淀。
- 使用台盼蓝染色法计数细胞，并用适量体积的含2% FCS的HBSS调整细胞浓度至107个细胞/mL。
4. 过继性转移
- 将获得的细胞悬液转移2 mL至5 mL收集管中。
- 在10°C条件下，以370 × g 离心7分钟，然后弃去上清液。
- 将沉淀用2 mL PBS重悬，再在10°C条件下，以370 × g 离心7分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL PBS中。
- 使用带有29G针头的0.5 mL注射器，将200 µL细胞悬液经眼后静脉窦注射至实验小鼠体内。
- 作为对照，向第二只小鼠的同一静脉窦注射200 µL磷酸盐缓冲液。
5. 细胞收获与染色
- 过继转移后第四天，处死小鼠并取出脾脏。
- 按照第3节所述方法分离脾细胞。
- 从每只小鼠中取100 µL细胞悬液，分别加入两个已标记为"对照"和"转移"的FACS管中。
- 在10°C下以370 × g 离心7分钟，然后弃去上清液。
- 配制含有四种抗体的混合液，抗体稀释比例见表1。
| 抗体 | 荧光染料 | 稀释比例 |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
表1：抗体混合物组成。 使用浓缩的抗体-荧光偶联物和HBSS配制四种抗体鸡尾酒。
- 向每管中加入 100 µL 混合液，然后在冰上避光孵育 20 分钟。
- 加入 1 mL HBSS 2%FCS，然后在 10°C 下以 370 × g 离心 3 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于 200 µL HBSS 2% FCS 中。
- 将重悬的细胞转移至新的、已标记的 FACS 管中。
- 使用流式细胞术，按照 FACS 方案所示，检测 CD45.2 阳性淋巴细胞的存在情况。
6. 数据分析
- 打开 "FlowJo" 软件，将每个样品管的文件拖入 "所有样品" 窗口中。
- 双击 "转移样品" 文件，以在点图上显示该样品中记录的细胞，其中纵轴为侧向散射 "SSC-A"，横轴为前向散射 "FSC-A"。
- 点击 "多边形" 工具，建立设门策略以选择淋巴细胞，然后利用细胞表面标志物（CD45.1、CD45.2）区分供体与宿主细胞，再进一步分析 CD45.2+ 细胞群体（CD3、CD4）。
- 使用 "对照小鼠" 文件重复上述分析步骤。
- 要可视化某一细胞群体，点击 "布局编辑器"。
- 将来自 "转移样品" 和 "转移的CD4细胞" 群体的 "转移样品" 与 "对照" 文件拖入 "布局编辑器标签页" 中。
- 将出现一个点图，显示 CD45.2+ 细胞和 CD4 淋巴细胞。
- CD45.2 标记的转移细胞应仅出现在 "转移小鼠" 的点图中。
过继性细胞转移是一种将特定细胞引入生物体的方法。该技术是研究多种生物学机制的有力工具，包括特定类型免疫细胞的作用机制。此外，过继性转移也是一种具有前景的新型治疗手段，可用于治疗多种疾病，例如需要进行骨髓移植的疾病，或癌症治疗——在后者中，可提取患者自身的T细胞，对其进行改造以识别并摧毁癌细胞，然后将其回输体内以对抗肿瘤。
在实验室中，动物模型常被用于研究过继性转移。例如，CD45.1 Rag gamma 基因敲除小鼠缺乏多种细胞因子的关键受体，而这些细胞因子对于造血干细胞向淋巴细胞的正常分化至关重要。因此，这些基因敲除小鼠的淋巴细胞发育受损，并且缺乏自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞和B细胞。
可以通过过继转移将缺失的免疫细胞引入这些免疫功能受损的小鼠体内。首先获取含有高浓度免疫细胞的供体小鼠组织（例如脾脏）。随后将组织解离，分离出包括免疫细胞在内的多种脾细胞。接下来，通过加入氯化铵-钾裂解缓冲液裂解不需要的红细胞，然后利用离心法将剩余的白细胞（即脾细胞）与细胞碎片分离。
最后，将纯化的脾细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，以深入研究这些细胞的功能。数天后，可通过与供体组织相同的方法首先分离并制备宿主脾细胞，来确认过继性免疫细胞转移是否成功。随后，使用针对供体免疫细胞标志物的标记抗体对这些细胞进行染色，以便通过流式细胞术（FACS）对其进行鉴定和分选。
首先，戴上实验室手套并穿上适当的防护装备。接着，先用洗涤剂清洗一对镊子和解剖剪，再用70%乙醇冲洗，然后用干净的纸巾擦干。通过将1毫升胎牛血清（FCS）与49毫升Hank's平衡盐溶液（HBSS）混合于50毫升离心管中，配制含2%胎牛血清的50毫升Hank's平衡盐溶液（HBSS）。通过移液器轻柔吹打溶液约10次，使其充分混匀。
按照 JoVE 视频方案“利用流式细胞术分离脾脏 B 淋巴细胞”所示，解剖已安乐死的小鼠并取出其脾脏。为了分离免疫细胞，首先将脾脏置于培养皿中的 40 微米细胞筛网上。用注射器活塞碾压脾脏，使其解离至培养皿中。用 1 毫升含 2% FCS 的 HBSS 冲洗活塞和筛网，以回收粘附的细胞。然后，将培养皿中解离后的脾组织悬液用移液器转移至 50 毫升离心管中。再用 5 毫升含 2% FCS 的 HBSS 清洗培养皿，并将洗涤液转移至 15 毫升离心管中。
在10°C条件下，以370 × g离心7分钟，然后小心取出离心管，避免扰动沉淀。接下来，去除上清液而不扰动沉淀，并将液体弃入适当的废液容器中。随后，向离心管中加入2毫升氯化铵-钾裂解缓冲液，通过反复吹打重悬沉淀并裂解红细胞。静置2分钟后，向重悬的沉淀中加入HBSS 2% FCS，使总体积达到14毫升。重复离心步骤。小心取出离心管，弃去上清液。然后，用移液器反复吹打，将沉淀重悬于5毫升HBSS 2% FCS中。接着，对悬浮细胞进行计数。取5微升细胞悬液与5微升台盼蓝混合，通过移液充分混匀。随后，轻轻将5微升稀释后的细胞悬液滴加在盖玻片与马氏计数板之间。在显微镜40倍放大倍率下，计数细胞数量。通过加入适量的HBSS 2% FCS，将细胞浓度调整至每毫升10的7次方个细胞。
开始过继性转移时，将两毫升细胞悬液转移至一个五毫升收集管中。在10摄氏度条件下，以370 × g离心七分钟，然后弃去上清液。接着，将沉淀重悬于两毫升磷酸盐缓冲液中，并在10摄氏度条件下，以370 × g再次离心七分钟。弃去上清液。随后，将沉淀重悬于200微升磷酸盐缓冲液中。使用带有29号针头的0.5毫升注射器，将200微升细胞悬液经尾静脉注射至实验小鼠的眶后静脉窦中。
过继转移四天后，处死小鼠并取出脾脏。随后，按照第三节所述方法分离免疫细胞。接下来，将每只小鼠的100微升细胞悬液分别转移至标记为对照组和过继组的两个FACS管中。在10°C条件下以370 × g离心7分钟，弃去上清液。现在，配制含有四种抗体的混合液，各抗体稀释比例见表一。向每管中加入100微升该混合液，避光冰上孵育20分钟。接着，向每管中加入1毫升含2% FCS的HBSS溶液，再于10°C以370 × g离心3分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于200微升含2% FCS的HBSS溶液中。将重悬的细胞转移至新标记的FACS管中。随后，按照FACS实验方案所示，通过流式细胞术检测CD45.2阳性淋巴细胞的存在情况。
现在，我们将检测从 CD45.1 宿主脾脏中分离出的 CD45.2 淋巴细胞的存在情况。首先，双击 FlowJo 图标，然后将所有样本窗口中每支管的文件拖入。接着，双击已导入的文件，以在点图上显示该样本记录的细胞，其中横轴为前向散射光（FSC-A），纵轴为侧向散射光（SSC-A）。使用多边形工具圈选淋巴细胞群体。此时将弹出一个新的子群标识窗口，点击“OK”。接下来，将纵轴设为 FSC-W，横轴设为 FSC-A。使用多边形工具如前所述选中单细胞群体。
接下来，双击圈出的细胞群，为所选细胞创建一个新的窗口。在新窗口中，将Y轴设为CD45.2，X轴设为CD45.1。点击T图标，并自定义坐标轴以放大图像。接着，点击多边形工具，圈出CD45.2阳性细胞。在亚群识别窗口中，将该细胞群命名为“转移细胞”，然后点击“确定”。在同一窗口中，点击矩形工具，选择CD45.2阴性细胞。在亚群识别窗口中，将该细胞群命名为“宿主细胞”，然后点击“确定”。接下来，双击已圈出的CD45.2阳性细胞群（即转移细胞群），为所选细胞创建一个新的窗口。在新窗口中，将Y轴设为CD3，X轴设为CD4。
接下来，点击多边形工具以圈选 CD4 CD3 阳性细胞。在此亚群鉴定窗口中，将您鉴定的细胞群命名为“转移的 CD4 细胞”。然后，使用对照小鼠文件重复之前的分析步骤。最后，为了可视化您的细胞群，请点击布局编辑器（Layout Editor）。将来自转移样本和对照样本文件中的“转移细胞”和“转移的 CD4 细胞”群体拖拽至布局编辑器选项卡中。此时将显示一个点图，分别代表 CD45.2 阳性细胞和 CD4 淋巴细胞。CD45.2 标记的转移细胞应仅出现在转移小鼠的点图中。
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Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.