Name: 使用FURA - 2上午皮层神经元的钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习使用Fura-2 AM钙成像技术实时监测皮层神经元内钙离子动态变化。该方法通过荧光显微镜在340 nm和380 nm波长激发下测量发射比率，精确计算细胞内钙浓度，为神经科学研究提供重要的功能分析工具。

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细胞培养
可采用既定技术培养细胞，但必须将细胞接种在涂有细胞黏附剂（如多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸或层粘连蛋白）的#1玻璃盖玻片上，以防止细胞在成像实验过程中脱落或移动。
溶液
可以使用多种生理溶液（包括细胞培养基）进行钙成像实验。但需要注意确保溶液中不含酚红，因为酚红会显著增加荧光背景。我们使用台氏液（Tyrodes solution），该溶液易于配制且成分模拟脑脊液，并添加0.1%牛血清白蛋白。通过使用60–90 mM氯化钾去极化以激活电压门控钙通道，或使用1 μM毒胡萝卜素（Thapsigargin，DMSO中储存浓度为1 mM）或2 μM离子霉素（Ionomycin，DMSO中储存浓度为1 mM）来激活储存操作型CRAC通道。为了证明钙水平升高源于钙内流，通常需要去除细胞外液中的钙。在去除钙时，必须保持二价阳离子（Mg2+ 和 Ca2+）的总浓度恒定。当以钾替代钠时，必须维持渗透压平衡。
台氏液溶液：
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>低钾 2 mM Ca2+Tyrodes（毫摩尔）</td>
<td>低钾 0 钙2+ 台罗德液（mM）</td>
<td>高钾 2 mM Ca2+Tyrodes（毫摩尔）</td>
<td>高钾 0 钙2+Tyrodes（毫摩尔）</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>129</td>
<td>129</td>
<td>5</td>
<td>5</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>5</td>
<td>5</td>
<td>129</td>
<td>129</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>2</td>
<td>0</td>
<td>2</td>
<td>0</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>1</td>
<td>3</td>
<td>1</td>
<td>3</td>
</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
<td>30</td>
<td>30</td>
<td>30</td>
<td>30</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>25</td>
<td>25</td>
<td>25</td>
<td>25</td>
</tr>
</tbody>
</table>
用 NaOH 调节 pH 至 7.4
Fura-2 钙染料的加载
我们将细胞加载乙酰氧基甲酯Fura-2（Fura-2 AM），该物质可穿过细胞膜，并被细胞内的酯酶去酯化，生成Fura-2游离酸。Fura-2加载的具体参数因细胞类型不同而有较大差异。我们建议通过配制多种含不同浓度Fura-2的加载液（浓度范围为1–4 µM），将细胞在加载液中孵育不同时间（从15分钟至2小时），并在室温及37°C条件下进行测试，以优化实验条件。以下为皮层神经元的一种简化操作方案：
<ol>
<li>首先，通过向 Invitrogen 提供的 50µg 冻干粉瓶中加入 50µl DMSO 来配制 1 mM Fura-2 AM 储存液。必须使用在氮气中密封保存的干燥 DMSO，并且需用针头穿刺隔膜取用 DMSO，以防止 DMSO 吸水。配制完成后，将 Fura-2 AM 溶液保存于避光干燥处。Fura-2 AM 的 DMSO 溶液在室温下可稳定 24 小时，在 -20°C 干燥容器中可稳定数月。</li>
<li>将 2 ml 培养基分装至 15 ml 锥形管中，预热至 37°C，然后加入 2µl Fura-2 AM 储存液，配制成 1µM 的 Fura-2 AM 工作液。剧烈涡旋振荡溶液 1 分钟。</li>
<li>将染色工作液转移至 35 mm 组织培养皿中，然后将带有细胞的盖玻片转移至该培养皿中。</li>
<li>将细胞在 37°C 黑暗环境的培养箱中孵育 30 分钟，准确计时。</li>
<li>准备一个含有 2 ml 不含 Fura-2 AM 的组织培养基的 35 mm 培养皿。将盖玻片从染色工作液中取出，转移至新的培养皿中。</li>
<li>将盖玻片安装至成像腔室。从 35 mm 培养皿中取出盖玻片后迅速安装至腔室，注意防止细胞干燥。我们使用 Warner Instruments 生产的成像腔室，该腔室可将载有细胞的 10 mm 盖玻片安装于底部，另一片盖玻片安装于顶部，形成三明治结构。两片盖玻片通过真空脂固定于腔室上，腔室两端各有一根管道，用于向腔室内灌注溶液。进液管连接注射器，出液管连接收集井，并通过连接真空捕集装置的吸管排出液体。</li>
</ol>
显微镜
我们使用配备氙弧灯（Sutter Instruments）、自动载物台（Ludl）、激发滤光片轮（Ludl）和冷却电荷耦合器件（CCD）相机（Hamamatsu Orka II）的倒置尼康Eclipse TE2000-U显微镜。该显微镜由运行Open Lab软件（Improvision）的Macintosh计算机控制。还有多种其他软件包可用于比率成像。成像时，我们使用尼康40、60或100倍油浸荧光物镜，其数值孔径（NA）超过1.2。
成像方案
<ol>
<li>校准显微镜载物台。</li>
<li>将Tyrodes溶液注入进样管路，注意避免产生气泡。</li>
<li>将灌流室连接至灌流管路，并再次用Tyrodes溶液冲洗灌流室，注意防止灌流室内形成气泡。</li>
<li>在物镜上滴加一滴镜油，将灌流室放置于显微镜载物台上，使用透射光对细胞进行聚焦。</li>
<li>使用340 nm和380 nm激发光通过目镜观察细胞的荧光情况。静息状态的细胞在340 nm下应较暗，在380 nm下应较亮。通常情况下，细胞暴露于紫外光的时间不应超过10至15秒，且应使用中性密度滤光片降低激发光强度，以避免光毒性。</li>
<li>使用相机观察细胞，并调节相机的增益和曝光时间，使在380 nm激发时获得接近饱和（但未饱和）的图像，而在340 nm激发时图像远低于饱和水平。若可能，曝光时间应保持在200 ms以下。一旦设定完成，除非同时调整背景值、RMin和RMax（见下文），否则不要更改相机的增益或曝光设置。</li>
<li>在每个波长下采集图像，并使用感兴趣区域（ROI）工具测量各波长图像中多个位置的背景强度。</li>
<li>计算背景值的平均值，并将该值输入成像程序中的相应位置。程序将从视野中每个像素中减去该背景值。</li>
<li>采集一张练习用的比值图像，并调整每个波长的阈值，生成仅包含细胞而无背景、且在细胞边缘附近区域无明显噪声的比值图像。</li>
<li>将最小比值（RMin）设置为视野中任意细胞最低比值的约90%。</li>
<li>将RMax设置为RMin的约12倍。在需要相互比较的实验之间，不得更改RMin或RMax，否则会影响比较的准确性。我们在成像系统上很少更改RMin和RMax的数值。</li>
<li>使用自动载物台定位计划成像的视野，并通过软件记录每个视野的位置。实验中通常采集五个视野。自动载物台移动至某一视野，采集比值图像后，再移至下一个视野。</li>
<li>设置时间间隔，根据预期信号类型，以0.1至10秒的间隔采集图像。</li>
<li>开始实验。</li>
<li>在测试钙成像系统时，常使用一些刺激手段，例如高钾Tyrodes溶液（65 mM KCl）或离子霉素（2 µM），以诱导细胞内钙浓度升高；也可使用无钙细胞外液（含EGTA或BAPTA等钙缓冲剂）以降低钙浓度。</li>
</ol>
分析
实验完成后，您需要将一系列比值图像转换为单个细胞或细胞内特定区域的钙离子动态变化的时间序列测量数据。具体操作步骤如下：
<ol>
<li>使用感兴趣区域工具（ROI）定义图像中用于测量钙信号的区域。通常建议至少设置一个覆盖细胞胞体的ROI。在定义ROI时，建议播放图像序列形成的视频，以确认细胞在实验过程中未发生移动。</li>
<li>使用软件采集每幅图像中每个感兴趣区域（ROI）的时间推移比率测量值。</li>
<li>将比率测量数据导入分析软件。需要查看特定细胞或感兴趣区域（ROI）的钙信号轨迹，对多个细胞或ROI进行平均，并将比率测量值转换为细胞内钙浓度值。我们使用一组在Igor Pro中编写的宏，可完成上述常规分析任务；但其他软件（如Excel）尽管使用上不太方便，也可用于分析。 </li>
<li>方程 [Ca] = (R-R分钟)/(R最大值-R)Sf*Kd 可用于将 Fura-2 比值转换为细胞内钙离子浓度。[Ca] 为钙离子浓度，R 为 Fura-2 340/380 比值，RMin 和 RMax 分别为无钙状态和钙离子饱和浓度下的 340/380 比值；Sf*Kd 为 Fura-2 的 Kd 值（室温下约为 120 nM）与一个缩放因子的乘积。为测量 R最小值，RMax 并且对于 Sf*Kd，必须进行体内或体外校准。体内校准需要结合膜片钳技术和钙成像技术，虽然操作较为复杂，但精度很高。体外校准可使用自制的校准室，该装置由两片盖玻片通过一片薄的盖玻片间隔物分隔而成，以形成一层薄溶液用于校准。测量Fura-2比值随钙浓度变化的最便捷方法是使用包含多种缓冲钙溶液和Fura-2游离酸的校准试剂盒。此类试剂盒可从Invitrogen（Molecular Probes）公司获得，并附有精确的使用说明。</li>
</ol>

<ol><li>Grynkiewicz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Lewis, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Dolmetsch, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+intracellular+Ca2%2B+stores+and+depletion-activated+Ca2%2B+channels+generates+%5BCa2%2B%5Di+oscillations+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li>
</ol>

在本演示中，我们已介绍使用 Fura-2 AM 进行钙成像的全部操作步骤。我们以皮层神经元作为模型，但钙成像技术可用于多种细胞，以实时测量细胞内钙离子浓度。进行该操作时，必须使用玻璃盖玻片而非塑料材质，因为塑料在紫外波长下常具有自发荧光，会干扰成像效果。此外，盖玻片需预先用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被，以防止细胞脱落。最后，向成像腔室灌注溶液时，务必避免产生气泡。

<table><tbody><tr><td>新物品</td><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1221</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>新物品</td><td>DMSO</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>MX1457-6</td><td>置于干燥处以防吸湿</td></tr><tr><td>新物品</td><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022-100G</td><td>4&amp;deg;下保存</td></tr><tr><td>新物品</td><td>成像腔室</td><td>Warner Instruments</td><td>型号 RC-20H</td><td></td></tr><tr><td>新物品</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>新物品</td><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>新物品</td><td>校准试剂盒</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>F6774</td><td>避光保存</td></tr></tbody></table>

使用fura-2 am对皮层神经元进行钙成像

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

钙成像是用于测量培养细胞中钙信号的常用技术。该技术利用基于BAPTA的有机分子钙离子指示剂染料，这类染料在结合Ca²⁺离子后会发生光谱性质的改变。钙指示剂染料可分为两类：一类是比率型染料，如Fura-2和Indo-1；另一类是单波长染料，如Fluo-4。比率型染料在钙离子作用下会改变其激发光谱或发射光谱，从而可通过在不同波长下的荧光发射或激发强度比值来确定细胞内钙离子浓度。与单波长探针相比，比率型染料的主要优势在于其比值信号不受染料浓度、光照强度以及光程长度的影响，因而可排除这些因素的干扰，独立地测定细胞内钙离子浓度。其中最常用的钙指示剂之一是Fura-2，其发射峰位于505 nM，在结合钙离子后激发峰从340 nm变为380 nm。本文描述了使用Fura-2检测神经元及其他可兴奋细胞中细胞内钙离子升高的方法。

钙信号在基因表达、细胞存活和分化等多种细胞过程中发挥关键作用。本文演示如何使用Fura-2 AM进行钙成像。钙成像是一种有价值的工具，可用于实时研究细胞内钙的调控及其对信号级联的调节作用。

使用Fura-2 AM对皮层神经元进行钙成像

钙成像是一种常用的技术，可用于测量培养细胞中的钙信号。钙成像技术利用钙指示剂分子的特性，这些分子在结合钙离子后会改变其荧光性质，从而允许通过荧光显微镜实时监测细胞内钙浓度的变化。

钙成像技术使我们能够研究在多种生理刺激下钙离子进入和离开细胞质的动态过程。开始进行皮层神经元的钙成像实验时，首先将细胞加载钙离子指示剂染料RA，随后在不含RA的培养基中将细胞置于灌流腔室，并放置于荧光显微镜下。用波长为340纳米和380纳米的光照射细胞，染料会吸收这些波长的光。收集染料在这两个波长激发下发射的505纳米荧光信号，通过这两个信号强度的比值即可计算出细胞内钙离子浓度水平。大家好，我是来自斯坦福大学神经生物学系 Ricardo Domish 实验室的 Im Mar Barreto。今天我们将向您展示一种用于测量神经元内钙离子升高的实验方法。现在就开始吧。用于此钙成像实验的皮层神经元可通过已建立的技术培养，但应接种于15毫米直径的1号盖玻片上。由于活细胞的低荧光成像需使用高数值孔径的物镜，而此类物镜需要油镜介质。此外，我们预先用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被玻璃盖玻片，以防止细胞在成像实验过程中脱落或移动。多种生理溶液（包括细胞培养基）均可用于钙成像实验。但是，请确保溶液中不含酚红，因为酚红会显著增加皮层神经元的荧光背景。我们使用模拟脑脊液的台氏液（Tyro solution），并添加0.1%牛血清白蛋白。开始细胞负载步骤时，配制浓度为1毫摩尔的乙酰氧基甲酯（c oxy methyl ester）FERRA 2或RA 2:00 AM的储备液。具体操作为：向含有50微克URA 2:00 AM的西林瓶中加入50微升DMSO。必须使用在氮气中包装的无水DMSO，并且需用针头穿刺隔膜取用DMSO，以防止DMSO吸水。不使用时，应将Fira 2:00 AM溶液保存在避光干燥处。FIRA 2:00 AM 溶于DMSO后在室温下可稳定保存24小时，在负20摄氏度下可稳定保存数月。接下来，将两毫升培养基分装至已预热至37摄氏度的15毫升锥形管中。然后加入 2 µL 的 fura 2-AM 原液，配制终浓度为 1 µM 的 fura 2-AM 溶液。剧烈涡旋振荡数秒，用镊子将该负载溶液转移至 35 mm 组织培养皿中。将贴有皮层神经元的盖玻片放入培养皿内。将神经元置于黑暗的培养箱中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，并精确计时。孵育期间，准备另一件 35 毫米的组织培养皿，内含 2 毫升不含 fira 2:00 AM 的组织培养基。孵育结束后，从加载溶液中取出盖玻片，并转移至新的培养皿中。将盖玻片浸入不含 fira 2:00 AM 的培养基后，将其装入成像腔室。我们使用 Warner Instruments 公司的 RC 20 H 成像腔室。在腔室两侧涂抹真空润滑脂，然后将盖玻片放置于腔室上，并轻轻按压使其就位。接下来，拧紧侧边夹具。然后插入盖玻片固定环。待细胞固定且成像室组装完毕后，继续进行钙成像步骤。对于细胞钙成像，我们使用配备氙弧灯的倒置尼康Eclipse TE

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生物学

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