Name: 光致交联未修改蛋白（PICUP）适用于淀粉样肽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 了解光致交联未修改蛋白（PICUP）技术如何用于分析淀粉样肽的寡聚体尺寸分布。该方法通过一秒强光脉冲交联二聚体和多聚体，为神经退行性疾病研究提供重要的结构生物学信息。

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本工作获得了美国国立卫生研究院/国家老龄化研究所（NIH/NIA）资助项目AG027818和AG030709、Larry L. Hillblom基金会资助项目2005/2E、阿尔茨海默协会资助项目IIRG-07-58334以及加利福尼亚州公共卫生部资助项目07-65798的支持。

1. 肽的制备
<ol>
<li>使用微量天平称取约 100–200 μg 冻干肽，并转移至已标记的、硅化涂层、低吸附性的微量离心管中。本实验中使用人源 Aβ40、Aβ42、降钙素和 GRF 的序列。</li>
<li>本实验中使用经 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）预处理的肽，以获得均一且无聚集物的样品。此步骤是必要的，因为预先形成的聚集体可诱导淀粉样蛋白迅速聚集，导致实验间重复性差5。其他方法如过滤和尺寸排阻色谱（SEC）也可用于制备适用于 PICUP 的无聚集物样品6。</li>
<li>为用 HFIP 处理肽，首先在冰上预冷 HFIP 容器，操作时需在通风橱内佩戴适当的防护装备（HFIP 具有挥发性和毒性）。冷却一个 250 ml 的瓶子通常需要 10–15 分钟。将 HFIP 加入预先冷却的含有冻干肽的管中，使肽的终浓度为 0.5 mM。</li>
<li>在室温下，将肽溶液置于水浴超声仪中进行超声处理 5 分钟。</li>
<li>轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育 30 分钟。</li>
<li>将管置于冰上冷却（1 分钟），然后将溶液分装为 10–50 μl 的等分试样，放入已标记的 0.6 ml 低吸附性管中。</li>
<li>通过通入温和的氮气流蒸发去除 HFIP，或在通风橱中敞口过夜。若选择过夜蒸发，应将敞口管置于管架中，并用一张较大的 Kimwipes 纸覆盖，以防止灰尘和颗粒污染。</li>
<li>将残留的 HFIP 在冻干机或离心浓缩仪中真空干燥 30 分钟，或在连接真空泵的干燥器中干燥 2 小时。in vacuo 干燥后，最终产物为附着在微量离心管底部的肽薄膜。若干燥充分，管子可在 −20 或 −80 °C 下密封保存较长时间（数月）。</li>
</ol>
2. 溶解经HFIP处理的多肽并进行光交联
<ol>
<li>在将经 HFIP 处理的肽用于交联反应之前，需先配制交联试剂和淬灭试剂。</li>
<li>称取过硫酸铵（APS，分子量 228.2 g/mol），用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）配制成 20 mM 溶液。使用涡旋振荡器混匀，直至溶液澄清。</li>
<li>用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）配制 1 mM 的三(2,2'-联吡啶)二氯合钌(II)六水合物（RuBpy，分子量 748.63 g/mol）溶液。使用涡旋振荡器混匀，并确认完全溶解。用铝箔包裹管子以避光。</li>
<li>为进行交联后的 SDS-PAGE 分析，可使用 5% β-巯基乙醇溶于 2× SDS-PAGE 上样缓冲液作为方便的淬灭试剂。也可选用 1 M 二硫苏糖醇（DTT，分子量 154.5 g/mol）溶于去离子水或适当缓冲液中。</li>
<li>将经 HFIP 处理的肽膜先溶于稀 NaOH 溶液，再加入磷酸钠缓冲液，使肽终浓度约为 30 μM。向含有肽膜的离心管中加入 60 mM NaOH 溶液，随后加入去离子水，使 NaOH 和水分别占最终体积的 10% 和 45%。用枪头刮下管壁内侧的肽膜，通过反复吹打混匀，并在水浴超声仪中超声 5 分钟。</li>
<li>加入 45% 的 20 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4），通过移液混匀，然后在 16,000 g 离心 10 分钟。另取部分未交联的肽样品与淬灭试剂混合，作为阴性对照备用。</li>
<li>将相机快门延迟时间调整为 1 秒。若照射时间过长，剧烈的自由基反应可能导致蛋白降解。装入相机快门，当使用新蛋白进行该方法时，可能需要优化照射时间。</li>
<li>典型的 PICUP 反应在 20 μl 体系中进行。将 18 μl 肽溶液转移至薄壁透明的 0.2 ml PCR 管中。</li>
<li>向肽溶液中加入 1 μl RuBpy，随后加入 1 μl APS，并通过移液混匀（反应体系中 RuBpy 和 APS 的终浓度分别为 0.05 mM 和 1 mM）。</li>
<li>迅速将反应管放入 1.8 ml 玻璃小瓶中，再将小瓶放入连接在相机机身前方的皮腔内。装上镜头保护盖，按下快门，使样品在皮腔内照射 1 秒。</li>
<li>照射完成后，迅速将小瓶从皮腔中取出，再将 PCR 管从小瓶中取出。立即加入 1 μl DTT 或 10 μl 还原性 PAGE 上样缓冲液以淬灭反应。对每份肽样品重复上述反应。</li>
<li>反应混合物可于 −20 °C 冻存，但不超过 7 天，或在冰上保存，随后进行 SDS-PAGE 分析及银染检测。</li>
</ol>
3. 交联肽产物的SDS-PAGE及银染
<ol>
<li>通过常规 SDS-PAGE 和银染法观察交联肽。</li>
<li>每泳道上样 5 μl 反应混合物，以获得每泳道约 130 pmol 的肽段。</li>
<li>为便于比较，应包含等量的未交联肽。同时加入标准蛋白质 ladder，用于直观估计肽段条带的分子量。</li>
<li>使用标准凝胶电泳装置进行电泳。我们采用 Invitrogen 的 XCell SureLock Mini-Cell 系统，并按照 Invitrogen 出版物 IM-1002《Novex 预制凝胶电泳指南》中的方法进行银染。</li>
</ol>
第4部分：代表性结果（图1）
<img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result%20no%20demarcation.png" alt="GRF、降钙素、Aβ40 和 Aβ42 的蛋白质交联 SDS-PAGE 凝胶电泳结果" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1">
图1：银染聚丙烯酰胺凝胶显示未交联（−）和光交联（+）的GRF、降钙素、Aβ40和Aβ42
PICUP 生成的 Aβ40 寡聚体的 SDS-PAGE 及银染分析显示，单体至四聚体的条带强度大致相似，随后更高阶寡聚体的丰度急剧下降7。未交联的 Aβ40 迁移速率对应的相对分子质量（Mr）与单体一致7。Aβ42 表现出不同的寡聚体尺寸分布。Aβ42 寡聚体包含 2–3 个组8。第一组为单体至三聚体，其条带强度随寡聚体级数增加而递减；第二组在四聚体至七聚体之间呈现类似高斯分布的模式，以五聚体和六聚体为峰值；第三组（此处未显示）包含 Mr 约为 30,000–60,000 Da 的寡聚体8。这些高 Mr 寡聚体通常在使用 SEC 分离的低分子量 Aβ42 时观察到，而在经滤膜或 HFIP 处理制备的肽段中则未见6。未交联的 Aβ42 主要产生两条条带：单体条带和一条宽泛的三聚体/四聚体条带，后者是由 SDS 引起的人为假象5,9。降钙素产生的寡聚体尺寸分布在单体至四聚体范围内显著偏离单调指数下降趋势，提示二聚体、三聚体和四聚体在反应前已预先存在7。作为对照的多肽 GRF 则产生从二聚体至六聚体的单调寡聚体分布，其表观相对含量随分子质量增加呈指数衰减。在其他实验中，也可观察到更高阶的寡聚体7。寡聚体条带的确切数目及其相对强度在不同实验间可能略有差异，具体取决于实际蛋白浓度、上样量以及银染染色步骤中的显色时间。

<ol><li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li>
<li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions%E2%80%94a+review+with+illustrative+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li>
<li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+chemistry+and+biology%3A+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers%E2%80%94what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aggregate-free%2C+low+molecular+weight+amyloid-%CE%B2+for+assembly+and+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+%28A%CE%B2%29+assembly%3A+A%CE%B240+and+A%CE%B242+oligomerize+through+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li>
<li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+%CE%B2-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+photochemical+cross-linking%E2%80%94a+new+tool+for+studies+of+metastable%2C+amyloidogenic+protein+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li>
<li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li>
<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

PICUP 最初被开发用于研究稳定的蛋白质复合物2。此后，该方法被应用于对不稳定淀粉样蛋白组装体的定量研究，包括 Aβ10、朊病毒以及与疾病相关的 PrPSc 11 和 α-突触核蛋白12。设计 PICUP 实验时必须考虑的最重要因素包括试剂的化学计量比、辐照时间以及样品制备流程。前两个问题可能需要通过实验进行优化，而后者则在很大程度上影响实验数据的解读。特别是对于淀粉样变性蛋白，要确定不稳定寡聚体的尺寸分布，必须使用无聚集物的起始样品。PICUP 的背景原理、作用机制、仪器设备、实验方案、优化方法、适用范围、改进形式、应用领域及局限性已在先前的文献中进行了详细阐述1,2,13。PICUP 可用于生成稳定的可溶性蛋白质寡聚体，这些寡聚体在经过分级分离和纯化后，可用于结构研究、细胞毒性检测、寡聚化抑制研究，以及作为分子识别工具开发的靶标。

<table><tbody><tr><td>Dolan-Jenner 200 W 白炽灯</td><td>其他</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Model 170-D</td><td>灯产生的热量&amp;#8211;对短时间孵育的样品无影响。</td></tr><tr><td>35毫米单镜头反光相机机身</td><td>工具</td><td>Pentax</td><td>SP500 模型</td><td>在我们的设置中，相机机身连接了一个风箱，为放置在距离光源10 cm处的样品提供了一个便于照射的腔室。</td></tr><tr><td>透明薄壁 PCR 管</td><td>其他</td><td>Eppendorf</td><td>951010006，由 Fisher L22-003-24 提供</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶（1.8 mL）</td><td>其他</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2，由 Fisher 03-340-60 提供</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>试剂</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>试剂</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 和 A&amp;#946;42</td><td>试剂</td><td>加州大学洛杉矶分校生物聚合物实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>降钙素</td><td>试剂</td><td>美国肽</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>三(2,2-联吡啶)二氯合钌(II)六水合物</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>涡旋至溶液澄清。用铝箔包裹RuBpy管，以避光保存。RuBpy需每次新鲜配制，且应在48小时内使用。</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>涡旋至溶液澄清。APS 每次现配，且应在 48 小时内使用。 </td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>可在进行SDS-PAGE分析时使用。</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS 样品缓冲液 (2x)</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; 微型细胞</td><td>工具</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine 凝胶（10-20%）</td><td>其他</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS 电泳缓冲液（10x）</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>银染快速染色试剂盒</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

未修饰蛋白质的光诱导交联技术（picup）在淀粉样肽中的应用

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

淀粉样变性蛋白组装成有毒寡聚体是包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、遗传性肌萎缩侧索硬化症以及2型糖尿病在内的蛋白质错误折叠疾病发病过程中的关键事件。由于这些蛋白质组装体具有亚稳态特性，使用传统方法（如电泳、色谱法、荧光法或动态光散射）难以对其寡聚体大小分布进行定量评估。淀粉样变性蛋白的寡聚体以亚稳态混合物形式存在，其中寡聚体同时发生解离为单体和缔合成更大组装体的过程。光诱导交联法（PICUP）通过共价交联稳定寡聚体群体，当与分馏方法（如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或尺寸排阻色谱法（SEC））结合使用时，PICUP能够捕捉交联前存在的寡聚体大小分布的快照。因此，PICUP可实现对亚稳态蛋白质群体的可视化和定量分析，并可用于监测蛋白组装过程，解析序列修饰与寡聚化之间的关系。1. 从机制上讲，PICUP 涉及 Ru 的光氧化2+在三联吡啶合钌(II)配合物（RuBpy）中，将钌还原3+通过在电子受体存在下用可见光照射。Ru3+是一种强效的单电子氧化剂，能够从邻近的蛋白质分子中夺取一个电子，从而生成蛋白质自由基1,2. 自由基是不稳定的高活性物质，因此会通过多种分子内和分子间反应迅速消失。自由基可利用未成对电子的高能量与另一个蛋白质单体反应，形成二聚体自由基，随后失去一个氢原子，生成稳定的共价连接的二聚体。该二聚体可进一步通过类似机制与单体或其他二聚体反应，形成更高阶的寡聚体。与其它光交联或化学交联方法相比，PICUP 具有以下优势3,4包括短暂（≤1 秒）暴露于非破坏性可见光，无需pre facto对天然序列的修饰，以及零长度共价交联。此外，PICUP 能够在广泛的 pH 和温度范围内实现蛋白质的交联，包括生理条件。在此，我们展示了 PICUP 在三种淀粉样蛋白——40 和 42 个残基的淀粉样 β 蛋白变体（Aβ40 和 Aβ42）以及降钙素，以及一种对照蛋白生长激素释放因子（GRF）——交联中的应用。

光诱导未修饰蛋白质交联（PICUP）技术可用于表征亚稳态蛋白质混合物中寡聚体的大小分布。我们展示了将PICUP应用于三种典型的淀粉样肽：淀粉样β蛋白的40和42个残基形式、降钙素，以及一种对照肽生长激素释放因子。

未修饰蛋白质的光诱导交联技术（PICUP）在淀粉样肽中的应用

淀粉样蛋白前体蛋白组装形成毒性寡聚体是包括阿尔茨海默病在内的蛋白质错误折叠疾病发病机制中的关键事件，……

可溶性淀粉样蛋白的寡聚体通过其细胞毒性作用被认为是神经退行性疾病病理生理学的基础。这些寡聚体在溶液中持续地形成和解离，这一特性使得对其结构的研究变得复杂，而结构研究对于开发抑制性分子以克服这一问题至关重要。采用未修饰蛋白质的光诱导交联或捕获方法。该方法包括将去聚集并溶解的淀粉样蛋白肽暴露于交联试剂中，并施加一秒钟的强光脉冲，以共价连接二聚体及寡聚体。随后可通过标准的生物化学技术分析寡聚体的大小分布。您好，我是来自加利福尼亚大学洛杉矶分校神经病学系巴坦实验室的 Far Rahimi。我是来自比恩实验室的 Al Mai。今天我们将向您展示一种用于未修饰蛋白质的光诱导交联实验方法。我们在实验室中采用此方法制备稳定的淀粉样蛋白β寡聚体，并研究寡聚体高分布状态下的结构修饰。该方法最初由Fancy和Coate发表，用于研究稳定的蛋白质复合物。随后，Battan等人将其应用于亚稳定淀粉样蛋白组装体的定量研究，包括a beta pram和alpha sycle。现在开始操作。首先，将预冷在冰上的六氟异丙醇（HFIP）加入含有1至200微克冻干肽的硅化低吸附管中，使终浓度约为0.5。毫摩尔浓度的HFIP可防止淀粉样肽聚集，从而提高实验结果的一致性。现在将肽管在室温下超声处理五分钟。超声处理完成后，轻轻涡旋混匀各管，并在室温下孵育30分钟。30分钟后，将多肽置于冰上冷却1分钟。冷却后的多肽可分装为10至50 µL的等分试样，置于0.6 mil低吸附管中。接下来将离心管放入通风橱中并打开管盖。为使 HFIP 过夜挥发，需用纸巾和 Kim 擦拭布包裹试管架，以防止灰尘落入管中。当大部分 HFIP 挥发后，必须将试管置于真空干燥器中抽真空两小时，以彻底去除残留的微量 HFIP。最终产物是试管内壁的一层薄肽膜。这些试管可在零下20或零下80摄氏度下保存数月。开始溶解及光交联步骤时，需先将肽膜溶解于稀氢氧化钠溶液中。加入氢氧化钠后，再加入去离子水和磷酸盐缓冲液，最终溶液应包含45%磷酸盐缓冲液、45%水和10%氢氧化钠溶液。如果管壁上残留有蛋白质薄膜，应将其刮入溶液中。使用移液枪头反复吹打悬浮的多肽，然后在水浴超声仪（Sonica）中进行超声处理，时间为一至两分钟。超声处理后，加入磷酸盐溶液，并通过上下吹打混匀。然后在 16,000 G 条件下离心 10 分钟。离心机运行期间，准备好相机以进行光交联拍照步骤。相机快门延迟应设置为一秒，并装入快门。离心管完成离心后，在透明的0.2毫升PCR管中分装18微升肽溶液。这些分装样品将用于光交联反应。交联前，务必留出部分肽溶液作为阴性对照。加入一微升过硫酸铵和一微升钌试剂。随后迅速将试管放入1.8 M玻璃小瓶中，并将该小瓶置于连接在相机机身前端的伸缩罩内。用镜头保护盖关闭相机并按下快门。此时样品已被照射一秒钟。较长的照射时间会引发广泛的自由基反应，导致蛋白质降解。辐照后，迅速取出0.2密耳的PCR管，加入10微升预先配制的含有β-巯基乙醇的上样缓冲液。交联后的肽段可在-20摄氏度下保存最多七天。在进行SDS-PAGE、分级分离和银染之前。为了检测交联的肽段，可采用常规的SDS-PAGE和银染方法来估算上样量。每5微升反应混合物应产生约130皮摩尔的肽段。建议使用Invitrogen公司的Xcel Sherlock mini cell系统进行凝胶电泳，并进行银染。根据Invitrogen出版物IM 1 0 0 2（NOX预铸胶电泳指南），在银染后分析SDS-PAGE凝胶，未交联的对照多肽GRF主要以单体形式迁移。交联的GRF产生连续的全寡聚体分布，从二聚体到六聚体均有，且寡聚体的表观相对条带强度随分子量增加呈指数级递减。未交联的降钙素主要以单体形式迁移，部分以二聚体形式存在。交联的降钙素产生的寡聚体大小分布，在该区域明显偏离单调的指数级递减趋势。从单体到四聚体的条带表明，在未交联状态下二聚体、三聚体和四聚体已预先存在。Aβ40 仅以单体形式出现，检测到的为 Aβ40 单体。所有泳道中从单体至四聚体的条带强度大致相似，随后更高聚体的丰度逐渐降低。未交联。Aβ42 主要产生两条带，分别为单体条带和三聚体条带。该三聚体条带是 SDS 交联产生的假象。Aβ42 显示出明显的不同寡聚体大小分布，包含两个群体。第一个群体从单体到三聚体，其强度随寡聚体级数的增加而降低。在第二群体中，四聚体到八聚体之间呈现出类似巨寡聚体的分布，其峰值出现在五聚体和六聚体处。我们刚刚向您展示了如何使用pika通过此方法对蛋白质进行交联。需要牢记的是，在使用淀粉样蛋白时，我们必须确保样品制备过程中无聚集物，以获得可重复的实验结果。此处展示的条件以及这些实验可根据感兴趣的离子进行实验性调整。就这些。感谢观看，祝您在使用拾取实验时好运。

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科研

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Biology

生物学

光致交联未修改蛋白（PICUP）适用于淀粉样肽

适配体是通过筛选获得的短链核糖/脱氧核糖寡核苷酸 体外...

阿尔茨海默病致病因子淀粉样β蛋白的适配体筛选

蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白 体外

虽然细胞表面蛋白的运输相对容易研究，但可视化细胞内蛋白的转运过程则困难得多。在此，我们使用包含光激活型GFP的构建体，展示了一种精确追踪淀粉样前体蛋白从高尔基体向下游区室转运及其清除过程的方法。...

利用光激活型GFP成像APP的细胞内转运过程

淀粉样蛋白-β（Aβ）注射动物模型可实现对特定数量和种类的Aβ片段进行给药，并减少各研究组内的个体差异。本方案描述了无需使用立体定位仪器即可进行脑室内（ICV）注射Aβ的方法，可在正常小鼠中诱导出类似阿尔茨海默病的行为异常。...

向正常小鼠脑室内注射淀粉样-β肽以急性诱导类阿尔茨海默病认知缺陷

本文报道了一种定制的高效液相色谱（HPLC）纯化方案，可获得高纯度的淀粉样蛋白β42（Aβ42）和淀粉样蛋白β40（Aβ40）肽段，这些肽段具有形成寡聚体的能力。淀粉样蛋白β是一种极易聚集的疏水性肽段，与阿尔茨海默病密切相关。由于该肽段具有淀粉样蛋白生成特性，其纯化过程具有挑战性。...

一种定制的高效液相色谱纯化方案，可获得高纯度的淀粉样蛋白β42与淀粉样蛋白β40多肽，并支持寡聚体形成

淀粉样蛋白沉积是多种疾病的特征，并可累及多个不同器官。本文介绍了荧光标记的共轭寡噻吩染色法结合荧光显微镜技术的应用。该染色方法在临床和科研环境中均为检测和研究蛋白质聚集体的有力工具。...

利用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像技术对经发光共轭寡噻吩染色的淀粉样组织进行成像

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

本方案描述了如何从合成肽制备Aβ寡聚体 体外...

A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。...

1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

本文介绍了如何应用偏振敏感双光子显微镜来表征无标记淀粉样超结构——球晶内部的局部有序性。同时描述了样品的制备与测量方法、所需装置的组装过程，以及数据分析流程，以获取关于淀粉样纤维局部排列结构的信息。...

偏振敏感双光子显微镜用于无标记淀粉样蛋白结构表征

本文介绍了一种系统性方法，用于描述淀粉样蛋白β 1-40（Aβ1-40）包被的20...

表征pH依赖性可逆自组装的Aβ 1-40包被金胶体

了解光致交联未修改蛋白（PICUP）技术如何用于分析淀粉样肽的寡聚体尺寸分布。该方法通过一秒强光脉冲交联二聚体和多聚体，为神经退行性疾病研究提供重要的结构生物学信息。

未修饰蛋白质的光诱导交联技术（PICUP）在淀粉样肽中的应用

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