Name: 组织特异性的伤害性和炎症介质的测量人体内生物活性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学习使用微透析导管从实验性晒伤皮肤中采集组织液样本，用于测量伤害性和炎症介质。该方法结合局部麻醉和灌注泵技术，可在体内实时监测疼痛与炎症的生物化学机制。

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实验性炎症的诱导：
<ol>
<li>使用校准的紫外线B光源（Saalmann Multitester SBB LT 499，Saalmann GmbH，Hereford，德国）在未晒黑的大腿皮肤上诱导一度晒伤。在开始微透析实验前24小时，通过施加足以引起暴露皮肤完全发红所需紫外线B光量的三倍剂量（即最小红斑剂量，MED的三倍）来诱导晒伤。每位受试者在研究开始前均测定其最小红斑剂量（MED）。通过紫外线计（RM 12，Dr. Grobel UV-Electronic GmbH，Ettlingen，德国）确保能量的精确输送。</li>
</ol>
导管置入与样本采集：
<ol>
<li>准备一个操作区域，包括无菌手套、1 把无菌持针器、1 支带鲁尔接头的 1 cc 注射器（配有 23 号（G）针头）、1 支 1 cc 注射器（配有 30G 针头）、1% 利多卡因、酒精棉片、2×2 英寸无菌纱布垫、一端连接于 4 cm 23G 针头的微透析导管（Dermal Dialysis，Erlangen，德国）以及 1.5 ml 微量收集管（Microcent collection tubes，E&amp;K Scientific，美国加利福尼亚州圣克拉拉）中，每100 µl样品加入4 µl蛋白酶抑制剂溶液，并置于干冰上。蛋白酶抑制剂溶液按照生产商说明，使用蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆）配制而成。</li>
<li>用乳酸林格液配制1%人血白蛋白溶液，并将其吸入1 cc鲁尔接头注射器中，确保注射器内无任何气泡残留。</li>
<li>将含有1%人血清白蛋白的乳酸林格液装入注射器，并置于安装在高精度输液泵（Pump 22，Harvard Apparatus，South Natick，MA）上的支架（微透析多注射器架，Harvard Apparatus，South Natick，MA）中。确保输液泵推动注射器的推杆与注射器活塞完全接触。在确认已将注射器直径准确输入泵后，设定泵速。常用的输注速率范围为2至4 µl/min。</li>
<li>确定计划采集样本的区域。当从人工诱导的炎症区域（如上述日晒伤）取样时，应计划将导管插入日晒伤区域的边缘。</li>
<li>用酒精清洁病灶或采样部位相对两侧边缘的小区域。这些清洁过的区域将作为微透析导管的预定插入点和穿出点。在这些部位皮内注射少量利多卡因，注射量以皮肤出现苍白（注射后皮肤变白）为标志，形成极小的皮丘（直径最大不超过2 mm）。在微透析导管的入口和出口处注射如此有限量的皮内利多卡因不会影响生物测定结果，但可显著减轻受试对象在导管插入过程中的疼痛感。</li>
<li>使用无菌技术，在附带的23G针头辅助下，将微透析导管插入所探查的皮肤区域，导管长度应覆盖整个区域。插入深度应位于真皮与皮下组织交界处。可通过光学方式验证插入深度是否合适。当针头及其附带的导管向前推进时，应引起皮肤轻微隆起及局部皮肤发白。不应出现出血现象；若发生出血，则提示针头插入过深，需调整插入深度。当针头穿过皮肤出口点后，用含1%白蛋白的乳酸林格液冲洗导管，直至观察到液体滴沿导管全长渗出。操作方法为：将注射器（23G针头）针端小心插入微透析导管远端，缓慢注入溶液。</li>
<li>冲管后，轻轻牵拉针头，使连接的导管通过皮肤。由于导管直径较小，因而较为脆弱，操作时需轻柔。持续牵拉导管，直至其完全穿过皮肤，即导管远端嵌入的较粗塑料管基部与皮肤穿入点接触为止。如上所述，操作结束时几乎无出血或无出血，表明导管位置理想。</li>
<li>将导管远端连接至置于输注泵支架上的注射器23G针头的尖端。操作时需小心，避免针头刺穿导管管壁，以免造成潜在的泄漏。</li>
<li>剪断导管近端的针头。</li>
<li>使用¼英寸粉色胶带，将准备好的1.5 ml Microcent收集管固定在靠近导管出口部位的皮肤处。将导管尖端置入收集管内，以收集微透析液。以预设流速启动灌注泵，并定期检查灌注量与收集量是否一致。若灌注量与收集量不一致，应排除皮肤穿入部位是否存在渗漏（有时可通过将嵌入皮肤穿入部位的塑料管段更紧密地拉紧在皮肤上来解决）。若灌注量与收集量仍不一致，则可能需要更换导管。</li>
<li>采样完成后，将样品置于干冰上，直至储存于-80ºC。</li>
</ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微透析技术与多重免疫分析技术的联合使用是一种有价值的实时、体内人体生物测定方法，可提供有关目标组织中生化事件的信息。结合疼痛测试等行为学检测，该方法可用于研究介导疼痛与炎症的生物化学物质之间的复杂相互作用。该方法在以下方面具有前景：1）识别介导疼痛和炎症的组织特异性生物标志物；2）揭示伴有外周组织病理改变的炎症性及慢性疼痛疾病的病理机制；3）探索新型候选药物及干预疗法的镇痛/抗痛觉过敏作用以及抗炎效应。

<table><tbody><tr><td>微透析导管</td><td>工具</td><td>皮肤透析</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pump 22</td><td>工具</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>工具</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RM-12 IP-65 Radiometer</td><td>工具</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>工具</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>5% 白蛋白</td><td>试剂</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液</td><td>试剂</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>其他</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

人体内生物测定法用于组织特异性检测伤害感受性和炎症介质

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

该体内人体生物测定方法可用于研究人类志愿者和患者。通过无菌插入的微透析导管（Dermal Dialysis，Erlangen，德国）从相关组织部位（如皮肤）采集样本。本示例展示了从人类志愿者实验性炎症皮肤中收集间质液的过程。样本采集可与其他实验检测联合进行。例如，同时评估局部释放的生化物质以及实验性炎症皮肤对疼痛刺激的主观敏感性，可建立关键的生化-行为关联，从而识别疼痛与炎症的生物标志物。在活体人体中实施的该检测方法有助于揭示疼痛和/或炎症相关组织特异性过程的作用机制。该方法也适用于评估现有或新型干预措施（如新药候选物）在治疗疼痛和/或炎症性疾病方面的有效性。

本文将详细描述利用微透析技术从人类受试者实验性炎症皮肤病变部位采集间质液的方法。间质液样本通常采用多重微球阵列免疫分析法进行处理，可在低至50微升的样本体积中同时检测多达100种分析物。

本文介绍了一种从相关组织部位（此处为实验性炎症皮肤）体内采集间质液样本的技术，用于检测介导疼痛和炎症的生化物质。

该体内人体生物测定可用于研究人类志愿者和患者。样本通过以下方式从皮肤等相关组织部位采集……

本视频开始于使用校准的紫外光源在患者大腿部位诱导实验性晒伤后24小时。局部麻醉给药后，将微透析导管插入皮肤切口之间的皮下组织，然后将其拉出皮肤。将灌注注射器连接至导管的近端，启动灌注泵后即可引起微透析液的流动与收集。采集后的样本可在分析伤害性感受和炎症介质前于零下80摄氏度保存。大家好，我是来自斯坦福大学麻醉学系的Martin Angst。大家好，我是Martha Tingle，高级研究护士，也是由Angst博士于1995年在斯坦福大学创立的人类疼痛实验室的负责人。今天，我们将向您展示一种在人类受试者实验性炎症皮肤中植入微透析导管以采集间质液的操作方法。在我们的实验室中，利用该技术研究与疼痛和炎症调控相关的关键生化物质在组织中的特异性释放。现在让我们开始吧。一种实验性皮肤炎症模型是人工晒伤。通过校准的中波紫外线（UVB）光源诱导一度晒伤。使用紫外线测量仪确保能量的精确递送。晒伤通常通过照射足以引起皮肤发红所需剂量的2到3倍的UVB光线来诱导。在采集标本前，准备一个操作区域，配备无菌手套、无菌持针器，以及装有23号和30号针头的1毫升鲁尔接头注射器。此外，还需要微透析导管，其一端连接一根4厘米长的23号针头。样本将收集到1.5毫升的微量离心收集管中，每100微升样本中加入4微升蛋白酶抑制剂溶液。蛋白酶抑制剂溶液按照制造商说明，使用蛋白酶抑制剂混合片剂配制而成。用乳酸林格液配制1%人血清白蛋白溶液，并将其吸入1毫升鲁尔接头注射器中，确保注射器内无残留气泡。将含有1%人血清白蛋白的乳酸林格液注射器装入固定在高精度输注泵上的支架中。可同时装载多个注射器，以从不同部位同步获取组织间液样本。确保输液泵推动注射器的推杆与注射器活塞完全接触。在确认已将注射器直径准确输入泵后，设定泵的流速。常用的输注速率范围为每分钟2至4微升。现在，您已准备好在置管前进行操作。当从人工诱导的炎症区域（如实验性晒伤）采集样本时，必须明确定义采样区域。计划将导管插入晒伤区域的边缘。使用酒精棉片清洁拟采集样本的病灶或C部位相对边缘的微小区域，这些清洁过的区域将作为导管的预定插入点和穿出点。使用1毫升注射器配30号针头，注入1%利多卡因，以注射时皮肤出现隆起为标志，每个部位注射量应足以形成直径不超过2毫米的微小皮丘。在微透析导管的进入点和穿出点注射少量利多卡因可减轻受试者的插管疼痛，但不应影响生物测定结果。操作过程中须采用无菌技术。借助附带的23号针头，将微透析导管插入所探测的皮肤区域。插入深度应达到表皮与皮下组织的交界处。向前推进针头及相连的导管时，可通过肉眼观察确认是否已充分插入。进针时应导致皮肤出现轻微的上翻折叠以及部分皮肤发白。若出现出血，则说明针头位置比预期更深，必须调整进针深度。当针头穿过皮肤的穿出点后，轻轻拉动针头，使连接的导管通过皮肤。操作必须轻柔，因为导管直径小且非常脆弱。继续拉动导管，直至其完全穿过皮肤，到达较粗的塑料管的基部。导管的远端末端应嵌入至与穿刺点皮肤相接触。此时应仅有少量或无出血，表明导管已正确放置。开始采集样本时，首先用含1%白蛋白的乳酸林格液冲洗导管。通过将带有23号针头的注射器小心插入微透析导管的远端，并缓慢注入溶液来完成此操作。冲洗导管直至在导管全长以及其末端均可见液滴。冲洗完毕后，将导管的远端连接至固定在输液泵支架上的注射器的23号针头尖端。避免针头刺穿导管壁，否则可能导致泄漏，需使用四分之一英寸的粉色胶带固定。将准备好的1.5毫升微量离心收集管紧贴皮肤放置，靠近导管出口端。将导管尖端置入收集管中，以便收集微量裂解液。以预设速率启动灌注泵，并间歇检查输注量与收集量是否一致；若两者体积不符，应检查皮肤穿入处是否有渗漏。渗漏问题有时可通过将嵌入塑料管部分的导管更紧密地固定在皮肤穿入部位来解决。或者，如果输送和收集的液体体积在采样完成后不一致，则可能需要更换导管。样品将置于干冰上，直至储存于负80摄氏度环境中。我们刚刚向您展示了如何使用微透析导管从实验性炎症皮肤中收集间质液。现在，我们可以对所获得的样品进行免疫分析，以检测疼痛和炎症的生物化学标志物。在进行此操作时，务必小心处理导管，缓慢推进导管，并保持导管管路无张力；在插入前，用少量为输注阶段准备的无菌溶液润滑导管，可能有助于操作。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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生物学

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