Name: 果蝇幼虫NMJ夹层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习果蝇幼虫神经肌肉接头解剖技术，用于免疫组织化学和成像分析。该方法通过固定、剪开和去除内脏等步骤，为神经生物学研究提供标准化的样本制备流程。

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开始之前
<ol>
<li>所有培养物均应在 25° C 下培养。</li>
<li>HL3.1 解剖缓冲液可预先配制。取 50 ml HL3.1 并置于冰上保存。</li>
<li>配制 15 ml 新鲜的含 3.5% 甲醛的 HL3.1 溶液，置于冰上保存。</li>
</ol>
幼虫解剖
<ol>
<li>在解剖板上滴一滴冷的 HL3.1 溶液。这可以防止动物样本干燥，并使其暂时麻痹，便于操作。</li>
<li>使用长镊子，选取一只处于三龄游走期的幼虫，并将其放入 HL3.1 液滴中。</li>
<li>首先，用短镊子夹住一枚 minutien 针 ，将针置于后端气门之间。动物通常会试图远离针刺位置，从而伸展身体，这有助于你将另一枚针准确地插入幼虫头部靠近口钩的位置。沿纵向拉伸动物身体，这将有助于你在切割时最大限度地暴露体壁。注意：如果你选择先固定头部，动物可能会将身体缠绕在针上，或来回甩动身体，造成固定困难。此时通常可通过移除原有的 HL3.1 并更换一滴新的冷溶液来重新麻痹动物。双手灵活的研究人员也可直接用手抓握并固定动物。</li>
<li>使用弹簧剪刀，在幼虫背部靠近后端固定针处稍前方做一横向切口。将剪刀的一侧刀片插入切口，沿背侧中线向头部方向进行纵向剪切。到达头端后，在固定针的左右两侧分别做横向切口。注意：最终的切割结果应在幼虫背侧沿头尾轴呈现出一个“I”字形。</li>
<li>移除内部器官。首先在幼虫上再添加数滴 HL3.1 溶液，使器官浮起，便于取出。先移除气管系统，然后用镊子夹住其余组织并将其整体取出。</li>
<li>在第 3 步中，你已在体壁上形成左右两个瓣状组织。按顺时针顺序将这两个瓣固定在板上，注意同时在水平和垂直方向上充分拉伸体壁。</li>
</ol>
固定
将每只动物在 HL3.1 溶液中用 3.5% 甲醛固定 25 分钟。用 HL3.1 溶液洗涤动物两次，每次 5 分钟。
储存
移除针具，并将幼虫转移至含有1× PBS的1.5 ml离心管中。若计划使用融合荧光标签对神经肌肉接头（NMJ）进行成像，应在两天内完成动物样本的成像。解剖后的幼虫可在4°C下保存最多一周。
代表性结果
正确解剖的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫包含几个关键要素。首先，操作时必须格外小心，避免损伤肌肉，尤其是第4、6和7号肌肉。这些肌肉是最常用于研究的，若受损，则应弃去该肌肉片标本，重新解剖另一只幼虫。其次，必须确保幼虫被充分拉伸，以便能够清晰区分每一块肌肉及神经肌肉接头（NMJ）。

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

本视频中演示的解剖技术可用于为多种实验方法制备黑腹果蝇（Drosophila）幼虫。如果存在荧光蛋白标签，可直接将幼虫装片并立即进行成像。否则，可通过免疫染色标记特定的突触区域。此外，还可对解剖后的幼虫进行电生理记录，以评估神经递质传递功能。
果蝇的神经肌肉接头（NMJ）自早期揭示其基本结构与功能的研究以来，已获得广泛关注1-4。在果蝇 NMJ 发育研究中发现的许多分子在脊椎动物中具有保守性4。因此，通过研究果蝇 NMJ 所获得的诸多认识适用于所有生物的突触生物学。一些潜在的应用包括轴突导向相关分子、运动神经元疾病、学习与记忆等方面的研究。

<table><tbody><tr><td>体视显微镜 &amp;#8220;体视显微镜&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>光源 KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>3mm Vannas 弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>15000-0</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS 镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11200-33</td><td>长镊子</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>短镊子</td></tr><tr><td>SylGard 182 硅酮弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td>3097358-1004</td><td>用于制作解剖板</td></tr><tr><td>甲醛 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢微型图钉 - 直径0.1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">HL3解剖缓冲液：（单位：mM）70 NaCl，5 KCl，0.2 CaCl2，20 MgCl2，10 NaHCO3，5海藻糖，115蔗糖和5 HEPES，pH 7.3。&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意尺寸）。置于37°C培养箱中过夜，使Sylgard完全固化。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意尺寸）。置于37°C培养箱中过夜，使Sylgard完全固化。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;br/&gt;Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意大小）。置于37°C培养箱中静置过夜，使Sylgard完全固化。</td></tr><tr><td colspan="4">Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意尺寸）。置于37°C培养箱中过夜，使Sylgard完全固化。</td></tr></tbody></table>

果蝇幼虫神经肌肉接头解剖

Drosophila Larval NMJ Dissection

TheDrosophila神经肌肉接头（NMJ）是研究突触发育和可塑性的经典模型系统。该模型被广泛用于Drosophila运动系统因其高度可及性而备受关注。它可以在单细胞水平上进行分析。每个半体节有30块肌肉，其在外周体壁内的排列方式已知。共有35个运动神经元以高度保守的模式连接到这些肌肉上。利用分子生物学和遗传学方法，可以构建转基因动物或突变体，进而研究其对神经肌肉接头（NMJ）形态和功能发育的影响。为了研究NMJ，必须仔细解剖每条幼虫。本文将演示如何正确解剖Drosophila通过移除所有内部器官而保留体壁完整，以获取用于神经肌肉接头（NMJ）研究的幼虫。该技术适用于为成像、免疫组织化学或电生理学实验准备幼虫。

本实验方案演示了如何解剖黑腹果蝇（Drosophila）幼虫，以制备用于神经肌肉接头的免疫组织化学和/或成像分析样本。

果蝇神经肌肉接头（NMJ）是研究突触发育与可塑性的成熟模型系统。其被广泛用于……

该操作首先将三龄幼虫放置在解剖板上。用大头针固定幼虫的前、后两端。使用剪刀剪开幼虫体壁，并用镊子移除内部器官。最后，在幼虫体壁的四个角各放置一根针，以在固定过程中保持其绷紧状态。大家好，我是来自哥伦比亚大学内外科医学院生理学与分子生物物理学系 Brian McCabe 实验室的 Jonathan Brent。今天我们将向您展示果蝇幼虫及第三龄幼虫（MJ）的解剖步骤。我们在实验室中采用此方法研究果蝇幼虫神经肌肉接头的突触发育。现在让我们开始。在果蝇幼虫中，每个半体节含有30块肌肉，其在体壁外围的排列方式已知。共有35个运动神经元以高度保守的模式支配这些肌肉。为了观察神经肌肉接头（NMJ），必须使用正确的解剖方法仔细解剖每条幼虫。该神经肌肉接头可用于免疫组织化学成像或电生理学研究。将一滴预先配制并置于冰上冷却的 HL 3.1 缓冲液滴加到解剖板上，开始实验操作。使用大型不锈钢镊子从培养瓶壁小心夹取一只游走期三龄幼虫。若观察到活动，则表明幼虫尚未进入化蛹阶段。将幼虫背侧朝上放置于解剖板缓冲液滴中。冰冷的缓冲液可使幼虫麻醉，并用镊子固定使其保持静止。将一枚穆尼欣针插入后端球状结构之间，再将第二枚针置于深色口钩附近，使幼虫被拉伸展开，便于后续剖开。使用弹簧剪在幼虫后端做一小段水平切口。将剪刀的一侧刀片插入体壁，并沿幼虫纵轴向前端做纵向剪切。随后，在幼虫前端，于固定针的左侧和右侧分别做水平切口。为了移除肠道等器官，向动物体内加入数滴 HL 3.1 缓冲液，肠道及其他器官会漂浮到溶液中，可用镊子将其从身体上分离。同时，将气管系统随其他器官一并移除。现在通过将切口产生的组织瓣固定向后，暴露内部的体壁肌肉。固定瓣膜时，务必将体壁在水平和垂直方向上充分展开。清除所有残留的器官组织，并清洗一次。加入新鲜的 HL 3.1 缓冲液后，即可用新配制的、稀释至 3.5% 的甲醛进行固定，用一倍体积的 XPBS 完全浸没幼虫和固定液，静置 25 分钟。固定结束后，用 HL 3.1 缓冲液清洗幼虫两次，每次三分钟。小心移除固定针，如有需要，将幼虫转移至含有 XPBS 的 1.5 毫升离心管中。幼虫可在 4 摄氏度下保存最多两天。为获得最佳结果，应立即使用解剖后的幼虫。正确解剖的果蝇幼虫包含几个关键结构。首先，务必小心不要损伤肌肉，尤其是第六、第七和第四对肌肉。其次，必须将动物充分伸展。否则，神经肌肉接头可能无法触及或难以辨认。在此可以看到一只解剖得当的幼虫。神经肌肉接头清晰可见，系统现已准备就绪，可进行实验。我们刚刚向您展示了如何解剖食道幼虫以研究其神经肌肉接头。进行此操作时，重要的是要保持肌肉的完整性。如果肌肉受损，将无法研究神经肌肉接头。就是这样。感谢观看，祝您的实验顺利。

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生物学

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