Name: 果蝇幼虫NMJ免疫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习果蝇幼虫神经肌肉接头免疫组织化学染色技术，通过一抗和二抗孵育、洗涤及封片步骤，可视化突触发育相关蛋白，为神经发育生物学研究提供可靠的实验方法。

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开始之前
<ol>
<li>配制以下溶液：PBT（含 0.1% Triton X100 的 1X PBS）、PBTB（含 0.2% BSA 的 PBT）和 PBTN（含 2% NGS 的 PBTB）。</li>
<li>解剖黑腹果蝇幼虫。请参见 Drosophila 幼虫 NMJ 解剖。</li>
</ol>
免疫组织化学
<ol>
<li>将幼虫转移至含有PBT的1.5 ml离心管中。用PBT洗涤幼虫两次，每次15分钟。注意：洗涤时，将1.5 ml离心管置于摇床上。用移液器吸去液体，并更换为新鲜液体。</li>
<li>吸去PBT。用PBTB洗涤两次，每次30分钟。</li>
<li>吸去PBTB。用PBTN洗涤两次，每次15分钟。</li>
<li>将样本在PBTN中稀释的一抗溶液中孵育，室温下孵育1小时，或4º C过夜。</li>
<li>用PBTB快速冲洗两次。注意：冲洗时加入溶液后立即吸出。</li>
<li>用PBTB洗涤两次，每次15分钟。</li>
<li>用PBTN洗涤30分钟。</li>
<li>在PBTN中稀释的二抗（以及如果使用了偶联一抗）溶液中孵育。</li>
<li>用锡箔纸包裹，室温孵育1.5小时。</li>
<li>用PBTB快速冲洗两次。</li>
<li>用PBTB洗涤两次，每次15分钟。</li>
<li>进行封片操作。</li>
</ol>
封片
注意：如果样品需立即成像，请使用甘油封片。如果样品在成像前需要储存（超过一周）或需要多次成像，请使用Prolong Gold封片。使用时，将Prolong Gold瓶置于65°C水浴中2-3分钟。取适量Prolong Gold，并置于45-50°C的加热金属块上保温。
<ol>
<li>将染色后的样本连同PBT倒入表面皿中。</li>
<li>在干净的载玻片上滴加适量甘油用于后续处理。</li>
<li>用镊子夹取样本边缘，将其从表面皿中转移至处理用载玻片上，确保样本以角质层朝下放置。</li>
<li>在处理用载玻片上，使用新的剃须刀片切除样本的头部和尾部。使用16号刀片的精细刀具（exacto-knife）效果更佳。</li>
<li>在另一张载玻片（封片用载玻片）上滴加少量甘油/ProLong 溶液，并用干净的镊子将其均匀铺开。</li>
<li>将解剖后的样本从边缘轻轻转移至封片用载玻片，注意避免翻转。尽量将样本按相同方向排列成行，每张载玻片上封片6–8个样本。</li>
<li>加盖盖玻片时，先将一侧边缘接触甘油/ProLong 溶液，然后缓慢松开，使其自然覆盖。</li>
<li>用指甲油密封载玻片。注意：[必须等指甲油完全干燥后才能进行成像，通常需要十分钟。若样本使用ProLong Gold封片，应在密封或成像前至少干燥三小时。]</li>
</ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

免疫组织化学（IHC）对于神经肌肉接头（NMJ）生物学研究至关重要，因为它能够实现对NMJ的可视化观察。该方法通过使用识别神经元膜（例如HRP）、突触前膜（例如CSP、SYT）和/或突触后膜（例如DLG）的抗体来实现。此外，也可对信号分子、结构蛋白或感兴趣的新型蛋白进行染色。随后，可对基因进行突变或异常表达，再通过IHC检测突触结构和/或神经元信号传导的改变情况。
神经肌肉接头的 果蝇 自早期研究揭示其基本结构和功能以来，已广受欢迎。1-4 在研究中已鉴定出的许多分子 黑腹果蝇 神经肌肉接头在脊椎动物中具有保守性。4 因此，通过对果蝇NMJ的研究获得的见解可能适用于多种系统中的突触生物学。一些潜在的应用包括研究参与突触发育、可塑性及神经系统疾病的相关分子。

<table><tbody><tr><td>体视显微镜 &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD 光源</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Adams&amp;#8482; Nutator 混匀器</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>No.1 精密切割刀</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>No. 16 刀片</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片试剂</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila 幼虫神经肌肉接头免疫组织化学

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

TheDrosophila神经肌肉接头（NMJ）是研究突触发育和可塑性的经典模型系统。该模型系统被广泛用于Drosophila运动系统因其高度可及性而备受关注。它可以在单细胞水平上进行分析。每个半体节有30块肌肉，其在外周体壁内的排列方式已知。共有31个运动神经元以高度保守的模式连接到这些肌肉上。利用分子生物学和遗传学方法，可以构建转基因动物或突变体，进而研究其对神经肌肉接头（NMJ）形态和功能发育的影响。免疫组织化学技术可用于清晰地成像NMJ的各个组分。在本文中，我们将演示如何使用抗体染色来可视化Drosophila幼虫神经肌肉接头

本方案演示了如何对解剖后的黑腹果蝇幼虫进行免疫组织化学染色。

Drosophila 幼虫神经肌肉接头免疫组织化学

果蝇神经肌肉接头（NMJ）是研究突触发育与可塑性的成熟模型系统。其被广泛用于……

本方案描述了如何对解剖后的幼虫进行免疫组织化学染色，以观察参与突触发育的蛋白质。整个实验过程中，使用1.7 mil的离心管进行一抗和二抗孵育，以及洗涤步骤。随后将幼虫转移至处理载玻片上，用精密刀片修整样本，再将待观察样本移至一滴抗荧光淬灭试剂中。在载玻片上，最终用指甲油将盖玻片封固。大家好，我是来自哥伦比亚大学内外科医学院生理学与细胞生物物理学系Brian McCade实验室的Jonathan Brent。我们利用该方法研究神经肌肉接头及发育中节点处突触形成的遗传调控。那么，让我们开始吧。在对果蝇三龄幼虫的神经肌肉接头进行免疫组织化学实验之前，首先需要正确地解剖幼虫。要学习这一操作步骤，请观看配套的视频文章《果蝇三龄幼虫神经肌肉接头解剖》。开始实验前，需配制三种新鲜溶液。首先，将去垢剂加入新配制的 PBS 中，制备 PBT 溶液。其次，取一份牛血清白蛋白，加入 PBT 溶液中。为了制备PBTB第三溶液，取一份正常的山羊血清（aqua normal goat serum），加入到PB TB溶液中，制成PBTN溶液。配制好这些溶液后，将幼虫转移至含有1毫升PBT的1.5毫升离心管中。这是第一次洗涤。每次洗涤均需更换幼虫浸入的溶液，然后将幼虫置于缓慢旋转的混匀仪中孵育。切勿将幼虫从一个离心管转移至另一个离心管，以免造成损伤。第一次洗涤在室温下进行，持续15分钟。混合15分钟后，用移液管将PBT更换为新鲜的PBT，再洗涤幼虫15分钟。更换洗涤液时，务必小心避免损伤幼虫。PBT洗涤完成后，用PBTB洗涤幼虫30分钟。用新鲜溶液重复此洗涤步骤，再持续 30 分钟。至此，PBTB 洗涤已完成。用 PBTN 洗涤两次，每次 15 分钟。在第二次洗涤步骤中，可将一抗用PBTN稀释至所需的使用浓度。洗涤完成后，将幼虫置于该抗体混合液中，在室温下轻轻混匀孵育一小时，或在4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，用移液管吸除一抗溶液，并用PBTB快速冲洗幼虫数次，以去除残留的抗体。为进行下一轮抗体孵育，先将幼虫在PBTB中洗涤一次，持续15分钟，再用PBTN洗涤两次，每次30分钟。将二抗按所需工作浓度稀释于PBTN中，将幼虫置于该混合液中孵育一个半小时。室温孵育时，需覆盖样品以避免光照，减少荧光素四号的光漂白。一个半小时后，移除二抗溶液，并用 PBTB 将幼虫再冲洗数次。随后，用 PBTV 洗涤幼虫，每次 15 分钟，共洗两次。此后所有幼虫的洗涤和储存过程均应尽量避免光照，因此务必将其遮盖保存。将幼虫从1.5毫升离心管转移至玻璃染色缸中的PBT溶液中。此时幼虫已准备好进行封片。将染色后的幼虫置于水浴中，用65摄氏度的延长金溶液加热处理2至3分钟。然后取一张载玻片，放置于设定为50摄氏度的加热金属块上保温。在处理玻片上加入一些PB TB。将幼虫转移至PB tb中。使用16号刀片的精细刀片将幼虫

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

果蝇幼虫NMJ免疫

本实验方案演示了如何解剖黑腹果蝇（Drosophila）幼虫，以制备用于神经肌肉接头的免疫组织化学和/或成像分析样本。...

果蝇幼虫神经肌肉接头解剖

本方案描述了一种对完整的黑腹果蝇（Drosophila...

体内成像完整果蝇幼虫的亚细胞分辨率研究

Drosophila melanogaster 的神经肌肉接头（NMJ）是研究正常突触功能以及某些神经系统疾病中突触功能异常的重要模型系统。本文介绍了一种用于解剖 Drosophila 幼虫运动系统的实验方案，以及对 NMJ...

活性区的分离与成像 果蝇 神经肌肉接头

形态学分析 果蝇 利用遗传镶嵌体研究幼虫外周感觉神经元的树突和轴突

抗体染色 果蝇 蛹可增强对成虫腹部发育遗传学的基因分析。我们介绍了针对分期蛹的解剖、固定及抗体染色的实验方案。 黑腹果蝇...

Drosophila 蛹腹部免疫组织化学

为了理解发育过程中如何形成复杂的细胞形态（例如神经元树突），准确检测微管排列方式至关重要。本文介绍了一种可靠的免疫组织化学标记方法，用于分析果蝇（Drosophila）幼虫体壁组织中树突状神经元的树突、气管、肌肉及其他组织的微管排列结构。...

感觉神经元树突、气管及肌肉中微管的免疫组织化学标记 果蝇 幼虫体壁

果蝇神经肌肉接头（NMJ）被用作研究突触形态与功能的模型。本视频介绍了研究人员用于表征 NMJ...

Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）定量分析：一种评估突触形态与功能的方法

本方案演示了如何利用邻近连接技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。利用该技术，Discs large 和 Hu-li tai shao...

检测 原位 蛋白质-蛋白质复合物在 果蝇 利用邻近连接技术检测幼虫神经肌肉接头

细胞内细胞器的形态、大小和位置在进化上是保守的，并且似乎直接影响其功能。了解这些过程背后的分子机制已成为现代生物学的重要目标。本文展示了如何通过应用定量技术来促进这些研究。...

为何定量至关重要：在表型水平上的特征描述 果蝇 幼虫神经肌肉接头

本报告提供了一种用于可视化神经肌肉接头的新样本制备方法 果蝇 幼虫。与传统方法相比，该方法在防止样品卷曲方面更为有效，尤其适用于 果蝇...

优化神经肌肉接头透射电子显微镜样品制备流程 果蝇 幼虫

本文介绍了一种用于可视化神经肌肉接头和肌细胞中微管网络的详细方案。结合黑腹果蝇（Drosophila...

使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头与肌细胞中微管网络的可视化

学习果蝇幼虫神经肌肉接头免疫组织化学染色技术，通过一抗和二抗孵育、洗涤及封片步骤，可视化突触发育相关蛋白，为神经发育生物学研究提供可靠的实验方法。

Drosophila 幼虫神经肌肉接头免疫组织化学

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