双光子现场斑马鱼的胚胎干切断和时间推移共焦成像
February 16th, 2009
在这里，我们描述了一个用于安装长期成像，双光子成像和组织损伤的技术，和时间推移共焦成像的斑马鱼胚胎的方法。
为了使用体内双光子成像切割轴突，将麻醉的斑马鱼胚胎定位在一滴 aros 中，因为它在由 TEFL 洗涤和盖玻片组成的专用腔室中硬化。将玻璃灯放置在腔室顶部，然后在验出前将其倒置。以 40 倍放大到要 exo mize 的区域上剪切的轴突的前图像 70 倍。
在激光器关闭的情况下，调高激光功率。短暂打开激光。在轴突的后像中，如果验身成功，您将看到散落的轴突碎片。
大家好，我是 Georgia O'Brien。大家好，我是 Sandra Rigo。我是 Shauna Martin。
我们来自加州大学洛杉矶分校分子细胞和发育生物学系的 Alvarez TI 实验室。今天，我们将向您展示在活斑马鱼胚胎中进行双光子鸡奸和延时共聚焦成像的程序。我们在实验室中使用该程序来研究外周体感轴突的退化和再生。
那么让我们开始吧。首先，我们将准备一种用于包埋的 1% 低熔点农业溶液。我们通过在微波炉中加热将 agros 溶解在双远端水中，然后将 Alec 浇水到小管中并储存在 42 摄氏度的加热块中。
第一个胚胎可以在受精后 22 至 24 小时放入 5% PTU 林格溶液中，以抑制色素的形成，色素是明亮的、自发荧光的，并且会在双光子显微镜上掩盖轴突。接下来，我们选择胚胎进行成像，并用镊子轻轻地将它们拉开，以去除它们的软骨。一旦选择了胚胎，它们就会通过向 PTU 振铃器中添加约 0.02%trica 来麻醉。
在继续之前，请确保动物对触摸没有反应。通过在玻璃或特氟龙环的一侧涂抹真空润滑脂并将其固定在玻璃盖玻片上来准备长时成像室。注意不要转移太多 PTU 铃声。
用玻璃移液管将一个胚胎转移到 42 度的农业溶液中。然后将装有一滴 agros 的胚胎转移到准备好的盖玻片上。转移后，在 agros 变硬时根据需要放置胚胎。
请记住，完成后成像室将被翻转，以便铜片成为顶面。如果您有一个电动阶段并且可以一次对多个位置进行成像，请对每个胚胎重复这些步骤。让农业玫瑰完全凝固。
然后用 0.02% tri canine PTU 铃声填充环。最后，将真空润滑脂涂抹在环的另一侧。然后用玻璃灯盖住它们。
将密封室翻转过来。现在我们已经准备好进行两个 4 吨重的 exo tomy 成像。为了准备成像，将安装的胚胎放在显微镜下的载玻片架上。
使用 40 x 0.8 数值孔径水物镜聚焦一个胚胎。然后打开激光。将激光器的波长设置为 910 纳米，功率为 30 毫瓦。
打开成像软件。我们为 Boar's Laboratory 使用在珊瑚中开发的扫描图像软件。在这种能力下，可以扫描磁场以查找将被切断的候选轴突。
找到后，拍摄目标轴突的图像。标记第一个和最后一个 Z 位置，获取图像并进行 Z 堆栈的最大投影。接下来，在要逐项显示的轴突分支上放大 70 倍。
将功率调高到 180 毫瓦，并将 Z 切片的数量设置为 1。按 grab 启动使用激光的单次扫描。这应该足以切断轴突，但是有必要为您的显微镜和实验目标优化此程序。
最后，缩小。将功率降低到 30 毫瓦，并拍摄我们新切断的轴突的图像。如果您的实验室没有定制的双光子内窥镜，也可以使用 Zes five 10 共聚焦双光子显微镜来切断轴突。
我们首先将安装好的胚胎放在载物台上，并使用 25 倍水物镜将其聚焦。接下来，在多轨设置中打开 Argonne 激光器中的两个光子，以便可以从一个切换到另一个。虽然两种激光器都用于检测 GFP，但双光子发射用红色表示，而氩激光发射用绿色表示。
为了区分两者，使用 Argonne 激光识别在 Z 设置下要承受的轴突。标记第一个和最后一个光学部分。拍摄共聚焦图像并创建 Zack 的最大投影。
关闭氩激光器，打开透射强度约为 9% 的双光子激光扫描。要确保轴突仍然清晰对焦，请单击停止按钮，以便裁剪工具可用。使用 Crop 放大感兴趣的区域。
通常我们放大到 70 倍左右。选择要受伤的轴突区域，并将该区域聚焦。可以在 mode 选项卡下检查缩放。
接下来，在 channels（通道）选项卡下，将两个光子的强度从大约 9% 透射更改为 15% 到 30% 透射。要激活新设置，请单击快速 XY 按钮，然后单击 Stop 停止 然后快速。为避免过度损伤，如果该程序有效，应将轴突视为分散的碎片。
最后，为确保轴突确实受损，请切换回 4 88 纳米氩激光器。拍摄另一个共聚焦图像并创建 Zacks 的最大投影。现在我们已经向您展示了两种使用双光子激光显微镜切断轴突的方法，我们将研究使用 zes LSM five 10 进行再生的共聚焦延时成像。
要准备延时成像，请务必在设置延时电影前至少 30 分钟打开加热载物台。将安装的胚胎放在显微镜下的载玻片架上。专注于具有所需空气物镜的一个胚胎。
我们使用 20 x 0.5 数值孔径物镜，打开蔡司 LSM 5 10 成像软件，然后打开适当的激光器并设置所需的配置。打开 scan stage 和 multi time 窗口。如果您有多次软件，请在多次窗口内定义第一个胚胎的位置和配置。
在扫描窗口上激活快速扫描，然后将载物台移动到所需的 XY 位置。在扫描窗口中标记第一个和最后一个 Z 位置。在扫描窗口中按 stop 然后按 mid，等待中间 Z 切片的扫描完成。
然后按舞台窗口中的 mark position。如果您只对一个胚胎进行成像，请单击多时间窗口中的 single location（单个位置）选项卡。单击 replace X， y， Z，然后单击 save configuration。
当要求覆盖之前的配置时同意。现在，您可以在 multi lo 窗口中设置图像采集参数。如果您有机械化阶段，则可以设置多个位置来对多个胚胎进行成像。
在这种情况下，您应该先选择 multiple locations 选项卡，然后再为第一个位置定义 X、Y、Z 和配置。此外，请确保 multiple locations 选项卡下方的下拉菜单位于位置 1 上，并且配置部分中的下拉菜单显示 multi lo one。在单击 Save configuration 之前，请在多时间窗口中定义剩余胚胎的位置和配置。
找到您的下一个胚胎按下快速扫描，然后将载物台移动到所需的 XY 位置，并在扫描窗口中标记您的第一个和最后一个 Z 位置。按 stop。然后在扫描窗口中，等待中间 Z 切片的扫描完成。
然后按标记位置 在舞台窗口中，单击 replace X， Y， Z.检查 multiple locations 选项卡正下方的下拉菜单是否位于位置 2 上，以及配置部分的下拉菜单是否显示 multi lobe two。然后单击 Save configuration（保存配置）。同意。当要求覆盖以前的配置时，请对其余 embryo 重复此过程。
在 multi lo 窗口中设置图像采集参数。在块列表中选择 GR GL 选项。然后输入所需的组重复次数。
这是共聚焦在每个位置采集图像的次数。在参数部分输入所需的权重间隔。这是从一次成像重复开始到下一次成像开始的时间量。
在配置部分选择 Zack XY。在底部输入您的基本文件名。单击 select image db 并选择您的数据库。
单击选项按钮，然后选择您的 MDB 文件夹以保存临时文件。选中 Keep final image open（保持最终图像打开）。保存最终图像，在 Zack 的中间，然后选择 Weight interval。
单击 okay 关闭选项窗口，然后单击 Start time 开始。在成像期间保持多时间窗口打开。现在是时候分析您的数据了。
延时摄影完成时。multi-time 软件会将您的所有临时文件编译为每个位置的摘要文件。如果要在影片完成之前停止影片，请确保按 finish 而不是 stop，以便创建摘要文件。
临时文件和摘要文件应自动保存到指定的 MDB 文件夹中。这是受精后 54 小时验血后延时共聚焦电影的代表性示例。第一帧显示了 ex otomy 前轴突的背视图，黄色箭头指向下一个时间的 ex otomy 部位。
失效电影在手术后 1 小时内开始，持续 12 小时。每 20 分钟收集 1 个共聚焦堆栈。这种延迟共聚焦电影在受精后 78 小时使用相同的参数记录。
第一帧显示了前鸡奸前轴突的侧视图，黄色箭头指向前鸡奸部位。我们刚刚向您展示了如何使用双光子鸡奸和延时共聚焦成像来产生精确的组织损伤并可视化活的斑马鱼胚胎。执行此程序时，重要的是要优化用于双光子激光器 ex sodomy 的功率，以避免造成过度损坏。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文描述了一种用于长期成像的斑马鱼胚胎安装方法，包括二光子成像和组织损伤技术。该技术允许对轴突进行时间序列共聚焦成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 成像技术
- 发育生物学
背景
- 斑马鱼是研究神经元发育的模式生物。
- 长期成像对于观察活体胚胎中的动态过程至关重要。
- 二光子成像允许深层组织成像，并且损伤最小。
- 理解轴突行为对于神经科学研究至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的斑马鱼胚胎成像方法。
- 促进对时间上的轴突动力学的研究。
- 实现实验操作的组织损伤技术。
使用的方法
- 将斑马鱼胚胎安装在专门的腔室中。
- 使用二光子成像来可视化轴突。
- 进行组织损伤技术以研究轴突反应。
- 捕捉时间序列共聚焦图像以进行分析。
主要结果
- 成功地对活体斑马鱼胚胎中的轴突进行成像。
- 切除后轴突碎片的观察表明组织操作成功。
- 证明了长期成像技术的可行性。
- 提供了关于发育过程中轴突行为的见解。
结论
- 该方法允许对斑马鱼胚胎进行有效的长期成像。
- 二光子成像是研究神经元动力学的有价值工具。
- 未来的研究可以在此技术基础上探索神经生物学的各个方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise, reproducible tissue damage in live zebrafish embryos to study axonal regeneration, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By combining two-photon axotomy with longitudinal confocal imaging, it provides quantitative, dynamic readouts of neuronal repair mechanisms. The approach de-risks mechanistic hypotheses by linking genetic or pharmacological interventions to functional axon recovery in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling controlled axon severing to assess gene or compound effects on regeneration.
- Operational Value: Provides a standardized lesion model for consistent evaluation of axonal repair pathways.
- Predictive Value: Supports target confidence through direct visualization of dose- or time-dependent recovery in sensory neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable axonal debris and regeneration metrics for high-content screening of neuroprotective or neurorestorative compounds.
- Reproducibility: Enables longitudinal imaging over 12-48 hours, supporting robust time-lapse assays for kinetic analysis of repair.
- Scalability: Compatible with multi-embryo mounting and automated confocal capture for parallel condition testing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral sensory axon injury, relevant to neuropathic pain and neurodegenerative indications.
- Translational Continuity: Bridges genetic target modulation to phenotypic axon regeneration outcomes in a vertebrate system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether targets influence intrinsic growth programs versus extrinsic guidance cues during recovery.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling hypothesis testing, assay generation, and mechanistic insight for neurotargeted programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axon regeneration variables after precise two-photon-induced injury.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable axon fragmentation and regrowth readouts for compound library evaluation.
- Analytics: Provides axonal debris presence/absence and regeneration kinetics as objective endpoints for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular interventions to functional axon recovery in a developing vertebrate nervous system.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and lesion platform for iterative target validation across multiple neurobiology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in axon regeneration studies through direct, observable lesion and recovery tracking.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized embryo mounting, laser power calibration, and confocal time-lapse parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to phenotypic regeneration outcomes early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on demonstrated effects on axonal repair kinetics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, two-photon laser safety, and confocal microscopy.
- Dependent on access to tunable femtosecond laser systems and inverted microscopes with Z-stack capability.
- Necessitates standardization of laser power and exposure duration across laboratories to ensure consistent axotomy efficacy.
- Involves optimization of anesthesia and mounting conditions to maintain embryo viability during extended imaging.
- Limited to superficial axon branches accessible via two-photon penetration; deeper tracts may require alternative injury models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:47
Introduction
1:28
Mounting Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging
3:25
Two-photon axotomy using a custom built two-photon microscope with a Chameleon Ti-Sapphire laser
4:42
Two-photon axotomy on Zeiss 510 confocal/ two-photon microscope
10:56
Outcome and Results
6:52
Confocal time-lapse imaging on Zeiss LSM 510
11:44
Conclusion
