双光子轴突切除与活体斑马鱼胚胎的延时共聚焦成像

使用活体双光子成像技术切断轴突时，将麻醉后的斑马鱼胚胎置于特制腔室中的阿罗斯（aros）液滴内，待其凝固。该腔室由聚四氟乙烯（TEFLON）制成，并配有盖玻片。在进行轴突切断前，将一块玻璃盖片置于腔室上方，然后将整个装置翻转至倒置状态。在切断前，先以40倍放大倍率拍摄你希望切断的轴突图像，再对目标区域以70倍放大倍率进行成像。

关闭激光后，调高激光功率。短暂开启激光，在轴突的残余图像中，如果横切术成功，您将看到散在的轴突碎片。

大家好，我是 Georgia O'Brien。大家好，我是 Sandra Rigo。我是 Shauma Martin。

我们来自加利福尼亚大学洛杉矶分校分子细胞与发育生物学系的 Alvarez TI 实验室。今天我们将向您展示一种在活体斑马鱼胚胎中进行双光子外显微术和延时共聚焦成像的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究外周躯体感觉轴突的退化与再生过程。

那么，让我们开始吧。首先，我们将配制1%的低熔点琼脂糖溶液用于包埋。将琼脂糖加入双蒸水中，通过微波炉加热使其溶解，随后分装至小管中，并置于42摄氏度的加热块中保存。

受精后22至24小时，可将胚胎放入含5% PTU的林格液中，以抑制色素形成；该色素具有强自发荧光，会遮蔽双光子显微镜下的轴突信号。随后，我们挑选适合成像的胚胎，并用镊子轻轻将其卵膜撕除。选定胚胎后，通过向PTU林格液中加入约0.02%三卡因（trica）进行麻醉。

在继续操作前，请确保动物对触碰无反应。通过在玻璃或聚四氟乙烯环的一侧涂抹真空脂，并将其固定在玻璃盖玻片上，以制备长期成像室。注意不要转移过多的PTU林格液。

用玻璃移液管将一个胚胎转移至42度的农杆菌溶液中。然后将胚胎连同一滴农杆菌溶液转移到预先准备好的盖玻片上。转移后，在农杆菌溶液凝固过程中将胚胎调整至所需位置。

请注意，成像完成后需将成像室翻转，使铜片位于顶部表面。如果使用的是电动载物台且可同时对多个位置进行成像，请针对每个胚胎重复上述步骤。让农杆菌玫瑰完全凝固。

然后用0.02%三卡因PTU林格液填充环形区域。最后，在环的另一侧涂抹真空润滑脂，再用玻璃盖片覆盖。

将密封室翻转过来。现在我们已准备好进行两次四吨重的全身成像。为成像做准备，将固定好的胚胎放置在显微镜下载玻片架上。

使用40倍、数值孔径0.8的水镜聚焦于一个胚胎。然后打开激光器，将激光波长设置为910纳米，功率设置为30毫瓦。

打开成像软件。我们使用的是由Boar实验室为珊瑚研究开发的Scan Image软件。在此功率下，可扫描视野以寻找待切断的候选轴突。

找到目标轴突后，拍摄其图像。标记Z轴堆栈的第一和最后一个位置，采集图像并生成Z轴堆栈的最大投影。接着，将目标轴突的分支区域放大70倍进行详细观察。

将功率调至180毫瓦，设置Z轴切片数为1。通过按下“grab”键，使用激光进行一次单次扫描。此操作通常足以切断轴突，但需根据您的显微镜设备和实验目标对该步骤进行优化。

最后，缩小视野。将功率降低至 30 毫瓦，并对新切断的轴突进行成像。如果实验室中没有自建的双光子显微镜，也可使用 Zes five 10 共聚焦双光子显微镜来切断轴突。

首先将固定好的胚胎放置在载物台上，并使用25倍水镜将其调至焦点。接着，在多通道模式下开启氩激光器中的双光子激发光源，以便能够在两者之间切换。尽管两种激光器均用于检测GFP，但双光子激发发射以红色显示，而氩激光器发射以绿色显示。

为了区分两者，使用阿贡激光在Z设置下识别出一条轴突。标记出第一和最后一个光学切片。采集共聚焦图像，并创建Zack的最大投影图像。

关闭氩离子激光器，并开启双光子激光扫描，透射率约为9%。为确保轴突仍处于焦点位置，点击停止按钮，以启用裁剪工具。使用裁剪功能放大目标区域。

通常我们将放大倍数调整至约 70 倍。选择需要损伤的轴突区域，并将该区域调至清晰对焦。放大倍数可在模式选项卡下进行确认。

接下来，在通道选项卡下，将双光子的强度从约 9% 透射率调整至 15% 到 30% 透射率。为启用新设置，请单击快速 XY 按钮，随后立即单击停止。为避免过度损伤，若操作成功，轴突应呈现为分散的碎片状。

最后，为了确认轴突确实已受损，切换回 488 纳米氩离子激光器。再获取一张共聚焦图像，并对 Z 轴堆栈创建最大投影。现在我们已经向您展示了使用双光子激光显微镜切断轴突的两种方法，接下来将使用 Zeiss LSM 510 共聚焦显微镜进行再生过程的时间序列成像。

为准备延时成像，请确保在设置延时录像前至少30分钟打开加热载物台。将固定好的胚胎置于载物台上的载玻片架中，并放置于显微镜下。使用所需的空气物镜对准其中一个胚胎进行调焦。

我们使用数值孔径为20 × 0.5的物镜，打开蔡司LSM 510成像软件，然后开启相应的激光器并设置所需的配置。打开扫描载物台和多时间窗口。如果具备多时间点软件，在多时间窗口中定义第一个胚胎的位置和配置。

在扫描窗口中激活快速扫描，然后将载物台移动到所需的 XY 位置。在扫描窗口中标记第一个和最后一个 Z 位置。按下停止按钮，然后在扫描窗口中按下中间按钮，等待中间 Z 层扫描完成。

然后在载物台窗口中按“标记位置”。如果仅对一个胚胎成像，请在多时间点窗口中点击“单个位置”选项卡。点击替换 X、Y、Z，然后点击保存配置。

当提示是否覆盖先前配置时，请选择同意。现在您可以在多点窗口中设置图像采集的参数。如果您使用的是电动载物台，可以设置多个位置以对多个胚胎进行成像。

在此情况下，您应在定义第一个位置的 X、Y、Z 坐标和配置之前，先选择“多个位置”选项卡。同时，请确保“多个位置”选项卡下方的下拉菜单处于位置一，且配置部分的下拉菜单显示为 multi lo one。在点击保存配置之前，需在多时间窗口中定义其余胚胎的位置和配置。

找到下一个胚胎压片的快速扫描位置，然后将载物台移动到所需的 XY 位置，并在扫描窗口中标记扫描的起始和终止 Z 位置。按下停止。随后在扫描窗口中选择中间 Z 层面，等待该中间层面的扫描完成。

然后按标记位置，在载物台窗口中点击替换 X、Y、Z。确认“多位置”选项卡下方的下拉菜单处于位置二，且配置部分的下拉菜单显示为 multi lobe two。然后点击保存配置。确认。当提示是否覆盖先前配置时，对剩余胚胎重复此过程。

在多通道窗口中设置图像采集参数。在模块区域列表中选择 GR GL 选项，然后输入所需的组重复次数。

这是共聚焦显微镜在每个位置采集图像的次数。在参数部分输入所需的时间间隔，即从一次成像重复开始到下一次成像重复开始之间的时间长度。

在配置部分选择 Zack XY。在底部区域输入您的基础文件名。单击选择图像数据库，然后选择您的数据库。

单击选项按钮，然后选择您的 MDB 文件夹以同时保存临时文件。勾选“保留最终图像打开”选项。保存最终图像，位于 Zack 中间位置，并选择权重区间。

单击“确定”关闭选项窗口，然后单击“开始时间”。在成像期间保持多时间点窗口处于打开状态。现在可以开始分析您的数据了。

当延时成像结束后，多时间点软件会将所有临时文件汇总为每个位置的摘要文件。如果需要在视频完成前停止拍摄，请务必按下“完成”而非“停止”，以确保生成摘要文件。

临时文件和汇总文件将自动保存到指定的 MDB 文件夹中。以下是一个在受精后 54 小时进行外切术的时间延时共聚焦显微电影的代表性示例。第一帧显示了外切术前轴突的背侧视图，黄色箭头指向下一个时间点的外切术位置。

延时成像在去眼手术后一小时内开始，持续12小时。每20分钟采集一次共聚焦图像序列。该延时共聚焦成像在受精后78小时以相同参数记录。

第一帧显示了轴突在双光子损毁前的侧面视图，黄色箭头指向双光子损毁位点。我们刚刚向您展示了如何利用双光子损毁技术和延时共聚焦成像来产生精确的组织损伤并观察活体斑马鱼胚胎。在进行该操作时，重要的是要优化双光子激光损毁所用的功率，以避免造成过度损伤。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。