Name: 大容量（20L）过滤沿海海水样品 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学习大容量海水过滤技术，使用蠕动泵和GFD预滤器收集0.22μm至2.7μm粒径范围的微生物生物量。该方法适用于海洋微生物多样性研究，为环境微生物学提供可靠的样品制备方案。

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我们感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）对沿海和开阔海域低氧区域持续研究工作的支持。D.A.W. 获得了来自 NSERC、Killam 以及由 TULA 基金会资助的微生物多样性与进化研究中心提供的博士后奖学金支持。

<ol>
<li>过滤装置的组装<ol>
<li>组装过滤装置时，使用镊子将一张 GF/D 级滤膜放入预过滤器外壳单元中。用手轻轻拧紧外壳。通常情况下，切勿过度拧紧，否则装置在开始抽滤时会发生泄漏。</li>
<li>将原装瓶盖替换为已灭菌的瓶盖及连接的导管，小心地将内部导管插入试剂瓶中，避免接触导管。如有必要，使用镊子引导导管进入试剂瓶。</li>
<li>将外部导管穿过蠕动泵。</li>
<li>将预过滤器外壳单元连接至两根外部导管的末端（即每个试剂瓶配两个单元）。使用钳子拧紧连接处。</li>
</ol></li>
<li>海水过滤<ol>
<li>开始过滤海水时，打开泵并将流速设置为 1。观察水流方向，确保水按正确方向被泵送。</li>
<li>让 500 ml 水自由流经预过滤器单元，流入 1 L 烧杯中。</li>
<li>关闭泵，将一个 Sterivex 滤器连接至预过滤装置自由端的雄性鲁尔接头处。用手牢固地拧紧预过滤器外壳。</li>
<li>观察预过滤器外壳以及外壳与通向试剂瓶的导管连接处是否有泄漏。若发生泄漏，关闭泵，松开并重新拧紧预过滤器外壳，再重新开启泵。</li>
<li>用 4 L 的烧瓶收集滤液。当烧瓶装满后，将滤液倒入洁净的试剂瓶中。务必记录每张滤膜所通过的液体体积。收集的滤液可进一步处理，例如用于病毒的过滤。</li>
<li>继续过滤，直至试剂瓶中无剩余水。通常每 20 L 试剂瓶的过滤时间在 4–5 小时之间；但该时间显著取决于水中生物量的多少。</li>
<li>过滤完成后，关闭泵并断开 Sterivex 滤器。</li>
</ol></li>
<li>滤器的保存<ol>
<li>保存滤器时，首先使用 30–60 ml 注射器排出滤器中残留的水分。</li>
<li>使用移液器向滤器中加入 1.8 ml 裂解缓冲液，保留约 200 µl 空间，以便后续添加试剂。</li>
<li>用一小块 Parafilm 封住 Sterivex 滤器的顶部和底部，并在滤器上标记日期和样品编号。</li>
<li>将滤器放入预先贴好标签的 50 ml Falcon 管中，于 -80°C 保存。</li>
<li>从外壳单元中取出滤器，放入含有 2 ml 裂解缓冲液的已标记 50 ml Falcon 管中。于 -80°C 保存。</li>
</ol></li>
<li>清理工作<ol>
<li>最后清理时，将曾插入试剂瓶内的导管放入盛有 0.1 M HCl 的烧瓶中。</li>
<li>将通向 4 L 烧瓶的导管重新导向原始试剂瓶中。</li>
<li>打开泵并以 3 的速度运行，将冲洗液收集至原始试剂瓶中。</li>
<li>最后，用已灭菌的水冲洗导管。</li>
</ol></li>
</ol>
代表性结果：最终结果为两个Sterivix滤膜，每个滤膜含有来自约10升海水的微生物生物量，其粒径范围分别为&nbsp;0.22 µm和2.7 µm。样品保存在裂解缓冲液中，可直接用于DNA提取。此外，该方法还会在GF/D预滤膜上收集并浓缩大于2.7 µm的生物量，同样保存在裂解缓冲液中，可用于DNA提取。若进行额外处理步骤，可进一步浓缩0.22 µm的滤过液，以收集病毒组分。

作者无任何利益冲突需要披露。

使用后必须用湿毛巾擦拭工作台和泵，以清除残留的盐水痕迹，否则会腐蚀设备。尽管该操作步骤简单，但所需时间可能较长，具体取决于待过滤样品中生物量或碎屑的浓度。

<table><tbody><tr><td>蠕动泵</td><td></td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>77913-20, 77200-62, 77200-04</td><td></td></tr><tr><td>Tygon LFL 软管</td><td></td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>06429-24</td><td>用于过滤装置</td></tr><tr><td>软管夹</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>0683204</td><td>用于过滤装置</td></tr><tr><td>1/4&amp;#8221; x 3/16&amp;#8221; 管道接头</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>31702-20</td><td>用于过滤装置</td></tr><tr><td>聚丙烯预滤器外壳</td><td></td><td>ADVANTEC</td><td>501200</td><td>用于过滤装置</td></tr><tr><td>金属鲁尔接头（软管端转雄性鲁尔锁）</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>31507-27</td><td>用于过滤装置</td></tr><tr><td>2&amp;#8220; 磁铁</td><td></td><td></td><td>用于过滤装置</td><td></td></tr><tr><td>三通瓶盖</td><td></td><td></td><td></td><td>用于过滤装置</td></tr><tr><td>GV 0.22 &amp;mu;m STERIVIX 滤器</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV01R5</td><td></td></tr><tr><td>直径 47 mm、孔径 2.7 &amp;mu;m 的 GF/D 滤膜</td><td></td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1823047</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td> 试剂</td><td></td><td></td><td>0.75 M 蔗糖，40 mM EDTA，50 mM Tris（pH 8.3）</td></tr><tr><td>0.1 % HCl</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>用于过滤后冲洗</td></tr><tr><td>高压灭菌水</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>用于过滤后冲洗</td></tr></tbody></table>

大体积（20升以上）近海海水样品过滤

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

该流程始于沿海海水样品的采集，用于后续的微生物群落、营养盐和痕量气体分析。本方法中的样品采自位于萨尼奇湾运行的 HMS John Strickland 船只甲板。本视频记录了从水体中过滤获取直径介于 0.22 μm 至 2.7 μm 之间的微生物生物量（体积 ≥20 L）的操作过程。使用配备四个旋转头的单台泵装置可同时过滤两份 20 L 的样品。在长时间出海任务中，过滤操作于现场完成；而在单日往返任务中，则在返回后立即进行。记录通过每个 Sterivex 滤器单元的水量至关重要。为防止采样间隔期间形成生物膜，所有过滤设备在使用后必须立即用稀盐酸和去离子水冲洗，并进行高压灭菌。该过程约需 5 小时，另加 1 小时用于清理。

本视频记录了从水体中过滤微生物生物量的过程，过滤体积较大（≥20 L），微生物直径范围在0.22μm至2.7μm之间。

实验流程始于沿海海水样品的采集，用于后续的微生物群落、营养盐和痕量气体分析。对于本方法，……

大家好，我是大卫·沃尔什（David Walsh），来自不列颠哥伦比亚大学微生物学与免疫学系霍尔姆实验室（Steven Hallam实验室）。今天我们将向您展示一种用于过滤大量海水以获取微生物生物量的实验方法。我们实验室利用该方法研究海洋环境中微生物的多样性。下面我们开始。设置过滤装置时，使用镊子将一张GFD级滤膜放入预过滤器外壳单元中。用手轻轻拧紧外壳。一般原则是，切勿过度拧紧，否则装置会发生泄漏。一旦开始泵送，立即用高压灭菌盖替换原瓶盖，并通过小心地将内管插入瓶内来连接管路，注意不要触碰瓶体。如有必要，可使用镊子引导管路进入瓶内。然后拧紧瓶盖，将外置管路穿过蠕动泵。将预滤器外壳组件连接到两根外置管路的末端。用钳子拧紧连接处，开始过滤海水。打开泵并调节流速至1个表盘刻度，以确保水按正确方向流动。让500毫升水自由流经预滤装置并流入一个1升烧杯中。关闭泵，并将Stax滤器连接到预滤装置自由端的公接头处。用手拧紧预滤器外壳。观察预滤器外壳及其与通向车辆的管路连接处是否有泄漏。如果发生泄漏，关闭泵，松开并重新拧紧预滤器外壳，然后重新启动泵。将滤液收集到四个升的烧瓶中。当烧瓶装满后，将滤液倒入干净的细口瓶中。务必记录每个收集滤器所通过的滤液体积。滤液可进一步处理，例如进行病毒过滤。持续过滤直至烧瓶中无残留液体。通常每20升烧瓶的过滤时间为4至5小时。然而，这在很大程度上取决于水体中生物量的多少。过滤完成后，关闭泵并拆下 Stax 滤器。用于储存滤器。首先用 30 至 60 毫升的注射器排出残留的水分。使用移液器向滤器中加入 1.8 毫升裂解缓冲液，滤器内保留约 200 微升的空间。后续添加试剂前，用一小块封口膜密封 Stex 滤器的底部和顶部，并用日期和样本编号标记滤器。将滤膜储存于预先标记的50毫升Falcon离心管中，置于负80摄氏度条件下。从滤器装置中取出滤膜，放入含有2毫升裂解缓冲液的已标记50毫升Falcon离心管中。将这些样品储存在负80摄氏度环境中。最后清理时，将曾置于车内的一段导管放入盛有0.1摩尔盐酸的烧瓶中。将通向四升烧瓶的导管插入原始的车内。启动泵并运行三分钟，将流出液收集到原始的车内。最后，用高压灭菌水冲洗管路。每20升海水样品可得到两个Stax滤器，每个滤器含有来自约10升海水、粒径在0.22至2.7微米之间的微生物生物量。此外，大于2.7微米的生物量则被收集并浓缩在GFD预滤器上。这些滤膜和预滤膜保存在裂解缓冲液中，可直接用于DNA提取。如果需要进行额外的处理步骤，也可以将0.2微米的滤过液浓缩，以收集病毒组分。我们刚刚描述了一种蠕动泵过滤法，可用于对直径大小在0.22微米至2.7微米范围内的浮游生物生物量进行大体积过滤。进行此操作时，重要的是在使用后用湿毛巾擦拭工作台和泵，以去除残留的盐水，否则可能会腐蚀设备。尽管该操作步骤简单，但所

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生物学

大容量（20L）过滤沿海海水样品

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