Name: 蛋白质组学鉴定蛋白质，P2X2配体门控的阳离子通道交互 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: 学习使用GST融合蛋白下拉实验和质谱技术鉴定P2X2受体C末端结合蛋白的方法。该方案可应用于其他P2X受体，有助于深入理解P2X受体在神经系统中的信号传导机制。

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SW 和 TMV 由美国国立卫生研究院下属的国家研究资源中心（NCRR）和国家心肺血液研究所（NHLBI）资助。BSK 和 HS 由美国国立卫生研究院下属的国家神经疾病与中风研究所（NINDS）和国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助。

实验步骤
实验步骤（图2）包括以下四个部分，将按步骤逐一描述。
第1部分：P2X2受体C末端的亚克隆与表达。
我们已在细菌中表达了P2X2受体的全长C末端，以鉴定与其结合的脑蛋白。
<ol>
	<li>通过 PCR 扩增 P2X2 受体的 C 末端（残基 353-472）（图 1），将其克隆至 pGEX 4NT1 载体（GE Life Sciences）中，并通过测序验证。</li>
	<li>将重组质粒转化至 E. Coli (BL21) 中以表达重组蛋白。</li>
	<li>用无菌移液枪头刮取含 P2X2 CT-GST 质粒的细菌甘油菌（E. coli BL21），接种于 5 ml 含适当选择性标记物（50 µg/ml 氨苄青霉素）的 Luria-Bertani（LB）培养基中，并在 37°C 摇床中过夜培养。</li>
	<li>将过夜培养的菌液按 1:50 接种至 250 ml 含适当抗生素（50 μg/ml 氨苄青霉素）的 LB 培养基中，在 37°C、250 rpm 条件下振荡培养 2-3 小时，直至 600 nm 处光密度达到约 0.6-0.7。</li>
	<li>加入 1 mM IPTG 诱导表达，并在 37°C 继续培养 3 小时以表达目标蛋白。</li>
	<li>在 4°C 条件下以 5000 g 离心 15 分钟收集菌体（保留 1 ml 培养物用于分析表达水平，标记为“诱导后”）。弃去上清，沉淀用 20 ml STE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8.0）重悬。</li>
	<li>将悬浮液在 50 ml 离心管中以 5000 g 离心 15 分钟，弃去上清，将半干沉淀于 -70°C 冻存过夜。</li>
	<li>将 -70°C 冻存的沉淀用 40 ml 冰冷裂解缓冲液（2%（w/v）月桂酰肌氨酸钠，15 mg 溶菌酶，150 mM NaCl，50 mM Tris，pH 7.5，5 mM DTT，以及一片完全蛋白酶抑制剂）重悬，并在冰上孵育 30 分钟。在此期间，将 3 ml 谷胱甘肽-Sepharose 4B 珠粒用 20 ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS）和 20 ml T-PBS（含 0.1%（v/v）Triton X-100 的 PBS）各洗涤一次，最后再用 PBS 洗涤一次，然后将珠粒重悬于 1 ml PBS 中。</li>
	<li>细菌悬液在液氮中反复冻融 3 次，随后在冰上进行超声处理（开 1 秒/关 1 秒，振幅 30 微米，持续 3 分钟），然后在冰上继续孵育 30 分钟，同时加入 4%（v/v）Triton X-100、10 mM MgSO4 和 2 mM ATP。</li>
	<li>裂解液在 4°C 以 20000 g 离心 15 分钟，弃去沉淀（分别保留部分沉淀和 1 ml 上清用于 SDS-PAGE 检测胞质与膜组分中的蛋白含量）。将上清与珠粒在 4°C 孵育 1 小时（或过夜）。</li>
	<li>以 500 g 离心 5 分钟收集珠粒，弃去上清（保留样品用于未结合组分检测）。珠粒用 T-PBS 洗涤 5 次（每次洗涤液保留用于洗涤对照）。</li>
	<li>将珠粒重悬于 PBS 中制成 50%（w/v）的悬液，4°C 冰箱保存备用。蛋白浓度采用 Bradford 法测定（按制造商说明书操作）。</li>
</ol>
第2部分：全脑裂解液的制备
已知P2X2受体在脑组织中高表达8。在本研究中，我们旨在从大鼠全脑裂解液中鉴定与P2X2受体相互作用的蛋白质（图3）。
<ol>
	<li>按照加州大学洛杉矶分校（UCLA）IAACUC批准的方案以及《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》的规定处死成年大鼠并取出脑组织，立即用预冷的 PBS 缓冲液（冰上）清洗 3 次。</li>
	<li>为了裂解细胞，向所获取的脑组织中加入 10 ml 冰冷裂解缓冲液（体积约为所获脑组织湿重的 5 倍），缓冲液成分如下：150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM PMSF、5 μg/ml 亮抑酶肽、1% (v/v) NP-40，并加入一片蛋白酶抑制剂混合物片剂。</li>
	<li>在冰上使用玻璃 Dounce 匀浆器对脑组织进行匀浆，直至形成均一稳定的混合物。</li>
	<li>将细胞裂解液在 2000 g 条件下离心 5 分钟，以去除未破碎的细胞；收集上清液后，再于 29000 g 离心 60 分钟，以去除完整的细胞器和膜聚集体。</li>
	<li>离心完成后立即转移上清液至洁净离心管中，采用 Bradford 法测定全脑裂解液的蛋白浓度（通常约为 ~15 mg/ml）。</li>
	<li>将裂解液分装后于 -70°C 保存。</li>
</ol>
第3部分：分离P2X2 C端尾部相关蛋白
为了鉴定P2X2 CT-GST在全脑裂解液中的结合蛋白，采用将CT-GST固定于谷胱甘肽-Sepharose 4B珠粒上的pull down实验作为诱饵。对照组使用结合在珠粒上的单独GST。
<ol>
	<li>脑组织裂解液在 4°C 下用 GST 琼脂糖珠预清除 1 小时。弃去沉淀，上清液用于后续分析。</li>
	<li>将等量结合在谷胱甘肽 Sepharose 4B 珠上的 GST 和 P2X2 CT-GST（各 10 μg）与 100 µg 经预清除的溶解态大鼠全脑裂解液蛋白在裂解缓冲液中于 4°C 旋转孵育过夜。</li>
	<li>珠子在 1000 g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>珠子用裂解缓冲液洗涤一次，随后在改良的 Laemli 缓冲液 [4% (w/v) SDS、10% (v/v) 2-巯基乙醇、2% (v/v) 甘油、0.004% (w/v) 溴酚蓝和 0.125 M TrisCl pH 6.8] 中煮沸 5 分钟。</li>
	<li>样品在 5000 g 离心 5 分钟，上清液进行 10% SDS-PAGE 分离（图 4）。凝胶使用 SYPRO® Ruby 蛋白凝胶染色剂（按照生产商说明）染色，并在紫外光下观察。将 P2X2 CT 相关蛋白与使用 GST-null 作为诱饵蛋白所获得的蛋白进行比较。共进行四次生物学重复实验（即四个脑组织样本及四次独立的 pull-down 实验）。</li>
</ol>
第4部分：蛋白质的鉴定。
通过凝胶电泳分离的蛋白质从凝胶中切下，并通过质谱法进行鉴定12。注意：整个操作过程中必须避免灰尘，以减少角蛋白污染。实验人员应始终佩戴口罩、头套和手套，且在未戴手套时切勿接触目标凝胶区域。
<ol>
	<li>从P2X2下拉实验中回收的所有可见蛋白质条带均用洁净的剃刀切下并切成小块（图4）。同样，也将GST-null下拉实验泳道中凝胶的相应区域以相同方式切下，无论其是否有条带染色（特异性结合GST-null诱饵的条带也被切下并鉴定），以确保不会遗漏染色灵敏度以下水平存在的蛋白质。</li>
	<li>将凝胶小块置于含有200 μl 50 mM碳酸氢铵和50%（v/v）乙腈（ACN）的溶液中，涡旋振荡15分钟（室温）。重复此洗涤步骤一次。</li>
	<li>加入200 μl乙腈使凝胶小块脱水（凝胶小块应收缩并变为不透明状）。</li>
	<li>去除乙腈，并将凝胶小块在真空浓缩仪中干燥约10分钟。</li>
	<li>随后将凝胶小块与30 μl新配制的10 mM DTT/10 mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）溶液（体积足以浸没凝胶小块）孵育，在56°C水浴中静置30分钟。</li>
	<li>弃去DTT溶液，加入100 μl含50%乙腈的500 mM碳酸氢铵溶液，用碳酸氢铵溶液洗涤凝胶切片。</li>
	<li>吸除洗涤液，加入200 μl乙腈以进一步脱水凝胶。</li>
	<li>去除乙腈后，加入100 μl新配制的100 mM碘乙酰胺溶液，用于烷基化游离巯基。该步骤在室温避光条件下进行25分钟。</li>
	<li>去除碘乙酰胺溶液，用200 μl含50 mM碳酸氢铵和50%乙腈（pH 8.0）的溶液涡旋洗涤凝胶小块2分钟。重复此洗涤步骤一次。</li>
	<li>去除洗涤液后，将凝胶小块与200 μl乙腈孵育，随后通过真空浓缩仪去除乙腈约10分钟。</li>
	<li>此时凝胶小块已准备好进行胰蛋白酶消化。将凝胶小块与30 μl胰蛋白酶溶液（工作浓度为20 ng/μL）孵育，并置于冰上10分钟，使凝胶充分溶胀。吸除多余胰蛋白酶溶液后，向再水化的凝胶颗粒中加入30 μl 50 mM碳酸氢铵溶液以保持其在整个消化过程中完全浸没，消化反应在37°C下持续进行12至16小时。</li>
	<li>加入5 μl 5%（v/v）甲酸以灭活胰蛋白酶并终止消化反应。</li>
	<li>将管子涡旋振荡约15分钟，短暂离心使液体沉至管底，然后转移至洁净并标记好的0.5 ml样品瓶中。</li>
	<li>接着向凝胶小块中加入30 μl含0.1%（v/v）甲酸的50%乙腈溶液，刚好覆盖凝胶，随后涡旋振荡两次，每次10–15分钟，中间进行短暂离心。此步骤重复一次，每次更换甲酸-乙腈溶液。</li>
	<li>收集最终液体，并将所有提取液合并至同一小瓶中。使用真空浓缩仪将体积浓缩至约30 μL。样品现可进行反相纳米液相色谱分析，并通过质谱进行蛋白质鉴定。在此特定示例中，该步骤在ThermoFisher公司的Orbi-trap串联质谱仪上完成（选择该仪器因其具有高质荷比精度、快速的蛋白质检测循环周期以及总体稳定的运行性能），尽管其他型号或厂商的仪器也可轻松结合前述方法使用。</li>
	<li>以下简要介绍质谱分析的详细参数与筛选标准。所有肽段均通过反相纳米液相色谱（Eksigent）分离，并以3 μl/min的流速加载至C18反相柱上。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流动相B为含0.1%甲酸和20%水的乙腈溶液。肽段以220 nl/min的流速洗脱，采用线性梯度程序：90分钟内从5% B升至50% B，随后5分钟内升至95% B，最后维持95% B持续5分钟。数据采集采用数据依赖模式，Orbi-trap用于MS扫描，LTQ用于MS/MS扫描。使用集成于Bioworks软件包中的SEQUEST算法，在大鼠IPI数据库（版本3.53）中对谱图进行搜索以鉴定肽段。每条肽段需满足以下标准：XCorr ≥2（+1电荷）、≥3（+2电荷）、≥4（+3电荷），且DeltaCN &gt; 0.1。所有用于蛋白质鉴定的谱图均经人工检查，若鉴定出的肽段少于两条，则不接受该蛋白质。仅当蛋白质在四次P2X2下拉实验中均被检出，而在GST-null下拉实验中均未出现时，才纳入后续分析。</li>
</ol>
<img alt="具有N端和C端以及氨基酸序列的跨膜蛋白结构示意图" src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
图1. P2X2受体亚基的示意图。A. 图示为P2X2受体亚基的拓扑结构。胞质区包含N端和C端。本研究中使用P2X2受体的C端（红色）作为下拉实验的诱饵。B. 本研究中使用的P2X2受体C端的氨基酸序列。
<img alt="P2X2蛋白纯化流程图；步骤包括转化、裂解和质谱分析。" src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2">
图2. 蛋白质表达、纯化、免疫共沉淀及鉴定实验方案的流程图与时间线。 我们展示了该实验方案的总体流程及相应时间安排。成年大鼠脑组织裂解液在进行免疫共沉淀实验前新鲜制备并立即使用。
<img alt="P2X2 C端蛋白分离流程；凝胶分离、胰蛋白酶消化、液相色谱-质谱/质谱分析示意图。" src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 3">
图3. 大鼠脑组织中P2X2受体C末端网络的二元蛋白质组学分析示意图。 将与GST蛋白融合并结合到GST磁珠上的P2X2受体C末端用于下拉实验。制备脑组织裂解液，并将蛋白与固定化的重组蛋白孵育。未结合的组分用裂解缓冲液洗涤。通过质谱分析鉴定所结合的蛋白质。
<img alt="显示蛋白质条带的SDS-PAGE凝胶；分子量标记；GST融合蛋白分析。" src="/files/ftp_upload/1178/1178fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4">
图4. P2X2受体C末端结合蛋白的鉴定。 Sypro染色凝胶显示了一组与GST融合的受体C末端相互作用的候选蛋白（蓝色框）。同时展示了仅GST（黄色框）和仅谷胱甘肽Sepharose珠子的对照泳道。箭头指示了被切下并用于质谱进一步分析的独特条带示例。

<ol><li>Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li>
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<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits.%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li>
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<li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription%2Ftranslation-related+proteins%3A+complimentary+separation+techniques+with+LC%2FMS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li>
<li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li>
</ol>

离子通道是一类重要的整合膜蛋白。它们含有充满水的孔道，可选择性地允许离子顺着其电化学梯度跨质膜移动。离子通道在开放状态和关闭状态之间进行门控。门控行为可由递质（例如ATP）触发，如P2X配体门控离子通道的情况，也可通过与其他蛋白质的相互作用进行调控。过去十年中，我们对P2X受体如何结合ATP13的理解不断加深，但辅助蛋白在调控P2X功能中的作用仍知之甚少。本实验方案所描述的方法旨在通过检测与P2X2受体胞内C末端相互作用的蛋白质（作为第一步），来鉴定P2X2受体形成的信号复合物。完整绘制P2X2受体信号复合物的图谱，将有助于深入理解这些引人入胜的离子通道的病理生理学机制。

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>试剂</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>试剂</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>试剂</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵 (APS)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷 (ATP)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>试剂</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>试剂</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸 (EGTA)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽 Sepharose 4B 微球</td><td>试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 (HCl)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基 (Luria-Bertani 培养基)</td><td>试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>亮抑酶肽</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁 (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠 (NaF)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠 (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>试剂</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟 (PMSF)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>蛋白标准品</td><td>试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基肌氨酸钠 (Sarkosyl)</td><td>试剂</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>螺口小瓶</td><td>工具</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO&amp;#174; Ruby 蛋白凝胶染色剂</td><td>试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>试剂</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>试剂</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap 串联质谱仪</td><td>工具</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳米液相色谱系统</td><td>工具</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇 (B-Mercapt&amp;#8211;thanol)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

蛋白质组学鉴定与p2x2配体门控阳离子通道相互作用的蛋白质

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

配体门控离子通道是神经系统中突触间通信的基础1。在哺乳动物中，存在三类配体门控通道：半胱氨酸环（cys loop）通道、谷氨酸门控通道以及P2X受体通道2。在这三类通道中，神经递质的结合均可导致通道孔道的开放，使离子顺着其电化学梯度跨膜流动。许多配体门控通道对钙离子也具有通透性3, 4，而钙离子可发挥下游信号转导作用5（例如基因调控），其效应持续时间可能远超通道开放本身。因此，配体门控通道可在从数毫秒到数天的广泛时间尺度上传递信号。鉴于其重要功能，有必要深入了解配体门控离子通道本身如何受到蛋白质的调控，以及这些调控蛋白如何调节信号转导过程。近期研究表明，可能大部分甚至所有通道都属于蛋白质信号复合物的一部分6。本文将阐述如何鉴定与P2X2受体胞内区C末端区域结合的蛋白质。
P2X 受体是一类由 ATP 门控的阳离子通道，由七个亚基（P2X1-P2X7）组成。P2X 受体在脑组织中广泛表达，介导兴奋性突触传递以及神经递质释放的突触前易化7。P2X 受体存在于可兴奋细胞和非可兴奋细胞中，在神经信号传导、炎症反应以及心血管功能中发挥关键作用8。P2X2 受体在神经系统中含量丰富9，是本研究的重点。每个 P2X 亚基被认为具有两个被胞外区域分隔的跨膜区段（TM1 与 TM2）7，以及胞内的 N 末端和 C 末端（图 1a）7。P2X 亚基10（P2X1-P2X7）在氨基酸水平上的序列同源性为 30-50%11。P2X 受体仅包含三个亚基，是离子型受体中结构最简单的化学计量比。P2X2 受体的 C 末端由 120 个氨基酸组成（图 1b），并包含多个蛋白质结合的保守位点，支持 P2X2 受体可能参与信号复合物形成的假说。然而，尽管已有研究赋予 P2X2 受体 C 末端多种功能9，但尚无研究描述通过全长 C 末端与该蛋白胞内侧结合的分子伴侣。在本方法学论文中，我们描述了一种蛋白质组学方法，用于鉴定与 P2X2 受体全长 C 末端相互作用的蛋白质。

我们描述了一种简单的方案，用于鉴定与ATP门控P2X2受体全长C末端结合的脑蛋白。将该方法拓展并系统地应用于所有P2X受体，有望加深对P2X受体信号转导机制的理解。

蛋白质组学鉴定与P2X2配体门控阳离子通道相互作用的蛋白质

配体门控离子通道是神经系统中突触传递的基础1。在哺乳动物中，配体门控通道可分为三个家族：半胱氨酸环（cys）...

该实验首先在细菌裂解后，对重组表达的嘌呤P2X受体（P2X2）C末端进行过表达，该蛋白被构建为谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白。纯化后的蛋白与谷胱甘肽-Sepharose 4B微珠孵育，并采用Bradford法测定其浓度。随后，将纯化的大鼠脑组织裂解液中的蛋白与结合在谷胱甘肽-Sepharose微珠上的P2X2受体C末端共同孵育，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离并切胶回收与P2X2受体C末端结合的蛋白复合物，最后利用质谱分析对其进行鉴定。您好，我是来自加利福尼亚大学洛杉矶分校生理学系JIT K实验室的Harpring。您好，我是来自加利福尼亚大学洛杉矶分校麻醉学系Tom Vka实验室的Sarah Walburn。今天我们将向您展示分离和纯化P2X2受体CTS的实验步骤。我们利用这些蛋白质来鉴定红色脑组织中的成分，在我们的实验室中，我们使用这些蛋白质来研究P2X2受体的功能影响。那么让我们开始吧。P2X2受体的胞质区由N端和C端组成。将使用P2X2受体的C末端作为诱饵进行下拉实验，图中还显示了用于本相互作用研究的P2X2受体C末端序列。为表达P2X2受体完整的C末端，可采用常规分子生物学技术，将受体C末端的编码序列（氨基酸残基353至472）插入PGE X4 NT1质粒中。将重组质粒转化至大肠杆菌BBL 21菌株中进行表达。含有重组质粒的细菌在LB培养基中于37°C培养。当菌液在600纳米处的光密度值介于0.6至0.8之间时。用1毫摩尔异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导培养物，并在37摄氏度下孵育3小时。3小时孵育结束后，从培养物中取出1毫升等分试样，留待后续分析。将剩余培养物在4摄氏度下以5,000 × g离心15分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于20毫升含Tris-EDTA的盐溶液中，然后将重悬的沉淀转移至50毫升离心管中。现在需将悬浮液在5,000 ×g条件下离心15分钟，以收集半干沉淀，并将沉淀于-70°C冷冻过夜。次日，将冷冻的沉淀重悬于40 mL预冷的裂解缓冲液中，置于冰上30分钟，期间保持重悬沉淀处于冰上。准备3 mL谷胱甘肽-Sepharose 4B珠。首先用 20 毫升 PBS 和 20 毫升 TPBS 清洗磁珠。随后用纯 PBS 再次清洗磁珠，并将其重悬于 1 毫升 PBS 中。将含有细菌的裂解缓冲液进行液氮冻融处理。将冷冻样品置于冰上孵育以解冻，并再次用液氮速冻。此步骤重复三次。接着，将冻融后的悬浮液在冰上进行超声处理。超声处理后，将细菌悬液与含有4% Triton X-114、10毫摩尔硫酸镁和2毫摩尔ATP的溶液在冰上孵育30分钟。然后在4°C下以20,000 × g离心15分钟，收集上清液。在弃去沉淀前，取少量沉淀连同上清液样品，用于分析胞质和膜中的蛋白质。将上清液与珠子在4°C下孵育一小时或过夜。孵育结束后，在500 × g下离心5分钟以沉淀珠子。弃去大部分上清液，但保留少量样品以代表未结合蛋白的组分。用25 mL TPBS缓冲液将沉淀的珠子洗涤5次，每次洗涤时保留少量洗涤液用于洗涤对照。最后，将珠子重悬于PBS中，配制成50%（重量/体积）的悬液，并于4摄氏度保存。可依据制造商说明书采用Bradford法测定蛋白浓度，预期浓度为500微克/毫升。为了鉴定P2X2-CT-GST在全脑裂解液中的结合蛋白，以固定在谷胱甘肽包被珠上的CT-GST作为诱饵进行下拉实验，同时设对照组。在此，使用与珠粒结合的 GST 单独作为诱饵，下文简称为 GST Knoll 大鼠脑裂解液。GST 融合蛋白结合实验按照标准方案制备，采用裂解缓冲液，并通过 Bradford 法测定蛋白浓度，估计为 15 毫克/毫升。在开始实验之前。将裂解液与GST磁珠在4°C孵育一小时后，用30微升GST磁珠在4°C预清除解冻的脑组织裂解液。在4°C下以1000 × g离心10分钟，沉淀磁珠。保留上清液，并留取少量作为对照。现在计算含有100微克预清除可溶性蛋白的裂解液体积，并将该体积的裂解液与10微克GST偶联磁珠以及10微克P2X2CT GST偶联磁珠混合。用裂解缓冲液将总体积调至200微升。将裂解液与磁珠在4摄氏度下于旋转仪中孵育过夜。第二天，将珠子在1000 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液。用1 mL裂解缓冲液将珠子洗涤3次。然后向珠子中加入50 µL改良的Lely缓冲液，并在该缓冲液中煮沸珠子5分钟。将煮沸后的样品在5,000 ×g下离心5分钟，然后将上清液在10% SDS-PAGE凝胶上进行电泳。将P2X2CT相关蛋白与使用GST-Nola诱饵回收的蛋白进行比较。分析的最后关键步骤是从此处开始，将凝胶中分离的蛋白质切下，用于质谱鉴定。在整个过程中避免灰尘的存在对于减少角蛋白污染至关重要。首先使用洁净的剃刀刀片从凝胶上切下条带，然后将每条带切成三个较小的部分，并将每个小段放入已标记的微量离心管中，对应 GST 凝胶中的相应区域。同样地，必须以相同方式切除无条带的胶块，无需考虑染色情况。为确保不遗漏低于染色灵敏度水平的蛋白质，将胶块与200微升50毫摩尔浓度的碳酸氢铵溶液及50%（体积比）乙腈混合，然后在室温下涡旋振荡15分钟。涡旋后，移除洗涤液并重复此步骤。移除最后一次洗涤液，然后加入 200 微升乙腈使胶粒脱水。胶粒应收缩并变为不透明状。在两分钟内去除乙腈，并将凝胶块干燥。使用真空离心浓缩仪干燥约10分钟，随后将干燥的凝胶块置于新配制的10毫摩尔DTT和10毫摩尔TEP溶液中孵育。溶液的体积通常约为30微升，必须足以浸没凝胶块。将凝胶条置于56摄氏度的加热块中，在溶液中还原30分钟。随后，移除DTT TEP溶液，并加入100微升含500毫摩尔浓度碳酸氢铵的50%乙腈洗涤液，涡旋振荡10分钟。洗涤后，吸去碳酸氢铵洗涤液，再加入200微升乙腈以脱水凝胶条。凝胶条应在两分钟内收缩并变为不透明状。除烷基化外，将任何游离的巯基用100微升新配制的100毫摩尔碘代乙酰胺溶液替代乙腈。在室温避光条件下孵育该混合物25分钟。孵育结束后，移除碘代乙酰胺溶液，并用200微升含50毫摩尔碳酸氢铵和50%乙腈的溶液涡旋洗涤凝胶碎块5分钟。此洗涤步骤重复一次。移除最后一次的洗涤液，将凝胶颗粒置于200 µL乙腈中孵育10分钟。移除乙腈，然后在真空离心浓缩仪中干燥样品。此步骤中，凝胶小块已准备好进行胰蛋白酶消化。加入30微升胰蛋白酶溶液（工作浓度约为20纳克/微升），冰上孵育10分钟。凝胶颗粒应充分膨胀。除去多余的胰蛋白酶溶液，将重新水合的凝胶颗粒浸入30 µL的50 mmol/L碳酸氢铵溶液中。在37 °C下孵育12至16小时以进行消化，随后加入5 µL的5%甲酸终止消化反应并使胰蛋白酶失活。然后将离心管涡旋振荡15分钟，之后短暂离心，使液体沉降至管底，并将含有消化后肽段的溶液转移至一支洁净并已标记的0.5 mL离心管中。接着，用约30 µL提取溶液覆盖凝胶碎块，提取溶液组成为含0.1%甲酸的50%乙腈溶液，涡旋振荡10至15分钟。将此提取溶液加入新的0.5 mL离心管中。重复此步骤。将提取液转移至新的半毫升离心管中，将含有过夜消化液和两次提取液的半毫升离心管置于真空浓缩仪中，浓缩至约 30 微升。此肽段溶液现可进行液相色谱-质谱-质谱（L-C-M-S-M-S）分析。采用反相纳米液相色谱分离蛋白质，使用C18反相色谱柱，通过Orbitrap进行MS扫描，LTQ进行MS/MS扫描，以数据依赖模式采集质谱图。利用集成在Bioworks软件包中的Sequest算法，将数据与大鼠IPI数据库比对以鉴定蛋白质，随后仅对在四次样本重复实验中均存在且在GST对照组中未出现的蛋白质进行人工谱图验证。凡在GST无拉下（no pull down）条件下出现的蛋白质，不应纳入后续分析。这是Cipro染色凝胶，显示了与P2X2受体C末端相互作用的一系列假定蛋白质。其中，蓝色框标注的是与GST融合的样品，黄色框标注的是仅含GST的对照泳道，以及谷胱甘肽。同时亦展示了仅含Sphero磁珠的结果。箭头指示了通过质谱进一步分析而切下的独特条带示例。我们刚刚向您展示了如何表达和纯化P2X2受体的CTOs。我们还向您展示了如何进行下拉实验并鉴定蛋白质相互作用分子。进行此操作时，重要的是要记住佩戴手套和发网，以减少样本中的角蛋白污染。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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