样品的制备 黑腹果蝇 采用悬滴法进行活体成像的胚胎制备

大家好，我是布鲁斯·里德（Bruce Reed），加拿大安大略省滑铁卢市滑铁卢大学生物系的助理教授。今天我们制作这个视频档案，旨在记录我们开发的一种用于制备软体胚胎以进行活体成像分析的新技术。

在使用果蝇胚胎进行活体成像分析时，我们经常采用延时成像技术，该过程可能持续数小时。因此，建立一种能够防止胚胎脱水和缺氧的技术显得尤为重要。此外，我们还希望开发一种能够避免对胚胎产生任何压迫的技术。

在样品制备过程中，我们开发出一种非常简单、廉价且高效的方法，称为悬滴法。悬滴法适用于利用体视显微镜或任何直立型复式显微镜对活体胚胎进行成像分析。这段延时录像展示了采用悬滴法制备的八个表达绿色荧光蛋白（GFP）的胚胎，并通过延时荧光显微镜成像。

此成像序列涵盖了超过四个小时的持续时间。运动的开始表明这些胚胎处于可存活状态。接下来，我们将为您详细逐步介绍如何进行悬滴法实验操作。

在标准的葡萄汁、卵或培养皿上收集胚胎。使用 Fly max 科学仪器公司的自动化 FLA 卵收集器，该自动化收集器可提供处于预定发育阶段的同步化胚胎收集。在准备手工处理胚胎前，将一段双面胶带粘贴到显微镜载玻片上，并撕去胶带的背衬。

悬滴实验方案需要使用一块厚度为五毫米的聚碳酸酯塑料板自制培养室。将该塑料板切割成显微镜载玻片的尺寸，并用旋转刀具切出一个深度为三毫米的凹槽。通过将一片裁剪至合适大小的组织纸放入培养室的凹槽中，并用蒸馏水浸润，从而实现活体成像培养室的湿度控制。

卤代烷油（Halo Carbon oil）非常适合用于活体成像协调发育的果蝇胚胎，因为它具有透气性且光学透明。将700系列和56系列的卤代烷油按1:1比例混合，可获得适用于果蝇胚胎操作的适宜黏度。可使用珠宝镊子或极细的画笔从葡萄汁琼脂平板上收集胚胎。

胚胎会相互粘连，并粘附在镊子尖端。它们很容易聚集成团，形成成团的胚胎。粘附在镊子上。

将吸头轻轻下压，接触此前制备好的装饰载玻片上胶带的黏性表面。在体视显微镜下观察胚胎的同时，用镊子侧面轻轻推动或轻拂胚胎，务必打开冠状层，但不可破坏内部的绒毛膜。

这需要稳定的手法、耐心以及一些练习。一旦外层冠状结构破裂，去氯化的胚胎容易粘附在镊子上。注意不要让去氯化的胚胎接触到胶带的粘性表面。

将去氯化的胚胎快速从胶带上取下并转移到封片上的石蜡油滴中可能会非常困难。建议将石蜡油滴放置在附近。用镊子尖轻轻接触封片上石蜡油滴的表面即可。

将胚胎从镊子上移入油滴中，可通过肉眼观察确认胚胎的转移，方法是在黑色背景下使用以倾斜角度设置的光纤照明光源，在对下一个胚胎进行氯化处理前完成此步骤。由于镊子在卤代烷油中具有浮力，因此擦拭掉镊子上的油是有帮助的。协调好的胚胎会漂浮在油滴的表面。

通过将胚胎推至油滴底部，并在悬滴法中快速翻转盖玻片，我们可以控制胚胎的位置和方向。我们将盖玻片翻转至活体成像培养皿的加湿孔腔上方。当盖玻片被翻转后，胚胎将贴附于盖玻片的下表面。

可在体视显微镜下检查胚胎的静止位置。若位置不理想，可重复操作。一旦胚胎处于理想位置，即用胶带将盖玻片固定在活体成像室上。

通过在胶带上打孔使腔室通风。胚胎现已准备好进行成像。