Name: 编制果蝇实时成像的胚胎使用悬滴协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习悬滴法制备果蝇胚胎进行实时成像的技术，该方法可有效防止胚胎脱水和缺氧，避免压缩损伤，适用于GFP荧光成像和长时间延时摄影，为发育生物学研究提供简单可靠的实验方案。

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我们衷心感谢加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）为B.H.R.提供的发现基金以及研究工具与仪器基金。同时感谢H. Oda和布卢明顿果蝇品系中心提供用于示例活体成像序列的遗传品系。

准备
<ol>
<li>在标准的葡萄汁琼脂平板上收集胚胎4。使用自动果蝇卵收集器（Flymax Scientific Equipment Ltd.）较为方便。采用同步化、分阶段的胚胎收集方法可减少为获得足量目标发育阶段胚胎而需进行的去壳操作次数。</li>
<li>通过在载玻片上粘贴一段双面胶带制备去壳载片；移除胶带背衬。</li>
<li>通过裁剪一块适合培养 chamber 孔径大小的组织来制备活体成像 chamber。将组织放入孔中，并用蒸馏水润湿。</li>
<li>按1:1比例混合卤碳油（Halocarbon Products Corp.）粘度系列700和系列56。该混合液可长期储存并重复使用。</li>
<li>在盖玻片（22 × 40 mm，No. 2）表面放置数小滴卤碳油。体积无需精确，但建议每滴约为20–40 µl。</li>
</ol>
步骤
<ol>
<li>在体视显微镜辅助下，使用珠宝镊子（5号）或极细的画笔从葡萄汁琼脂平板上收集胚胎。胚胎容易相互粘连，并粘附在镊子尖端，因此常成团聚集。</li>
<li>在体视显微镜辅助下，轻轻将粘附在镊子尖端的胚胎团块放置到去壳载片的胶带表面。</li>
<li>再次使用体视显微镜，用镊子侧面轻推或轻拂胚胎，以打开外层蜡质卵壳，同时避免破坏内层的卵黄膜（若卵黄膜破裂，胚胎会爆裂）。</li>
<li>一旦外层卵壳被打开，小心将胚胎从卵壳中分离；去壳后的胚胎容易粘附在镊子表面。注意避免让去壳胚胎接触胶带表面。</li>
<li>一旦胚胎完成去壳，立即迅速将其转移至盖玻片上预先准备好的碳氟油液滴中。将携带去壳胚胎的镊子尖端接触碳氟油液滴表面，使胚胎脱离镊子进入油中。</li>
<li>确认胚胎已成功转移至油滴中。可在黑色背景下借助斜向照射的光纤光源，用肉眼观察确认。</li>
<li>在尝试去壳下一个胚胎前，需清除镊子上的油迹。若镊子表面沾有油，会降低对卵壳表面的抓力，使去壳操作更加困难。</li>
<li>去壳后的胚胎在碳氟油中具有浮力。在体视显微镜下，使用镊子或画笔将胚胎推至油滴底部，并调整至所需位置。</li>
<li>迅速将盖玻片翻转覆盖在活体成像室的孔腔上。确认胚胎以所需方向紧贴盖玻片。由于在油中的浮力作用，胚胎将上浮并紧贴盖玻片的下表面。用胶带将盖玻片固定在活体成像室上，并在胶带覆盖盖玻片末端与成像室孔腔末端之间的间隙处打孔，以实现通气。</li>
<li>现在可使用正置荧光显微镜或荧光体视显微镜对胚胎进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

我们介绍了一种用于活体成像分析的黑腹果蝇胚胎制备新方法，称为悬滴法。遗憾的是，若使用倒置显微镜，则无法应用悬滴法。在此情况下，必须采用夹心法（如上文摘要所述），而胚胎受压问题仍然需要关注。
在通过测量细胞形态和大小以计算与形态发生运动相关的作用力的实验中，由于能够减少胚胎受压，使用正置显微镜和悬滴法更为可取。&nbsp; 此外，采用悬滴法减少胚胎受压会呈现出胚胎圆形、无变形的表面，而夹心法呈现的则是扁平化的表面。&nbsp; 因此，在使用共聚焦显微镜时，相较于夹心法，采用悬滴法需要采集更宽的Z轴堆栈（每堆栈包含更多切片）。&nbsp; 然而，每个Z轴堆栈中切片数量的增加，也会延长采集时间，并加剧激光激发所导致的光毒性或光漂白效应。&nbsp; 显然，减少压缩所带来的实验优势在一定程度上被Z轴堆栈采集时间的延长所抵消。&nbsp; 尽管如此，我们观察到采用悬滴法时胚胎仍具有良好的存活率。
悬挂液滴法还仅限于通过荧光显微镜观察胚胎，因为在这种情况下，入射光和发射光的光路不会穿过活体成像室。若要使用微分干涉差（DIC）显微镜或其...

<table><tbody><tr><td colspan="4">用于通过悬滴法准备活体成像胚胎的标准设备和材料包括以下物品：显微镜载玻片</td></tr><tr><td>盖玻片（22 × 40 mm，No. 2）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>珠宝商&amp;rsquo;Dumont 5号镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卤代烃油系列56和系列700（Halocarbon Products Corp.）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>美工刀或单刃剃刀刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>适用于移取 20-40 的移液器 &amp;mu;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">活体成像实验还需要一个自制的活体成像室。该成像室通过将一块5 mm厚的聚碳酸酯塑料板切割成标准显微镜载玻片的尺寸（75 × 25 mm），并使用旋转工具在载玻片上制作一个深3 mm、大小为20 × 55 mm的凹槽而制成。实验还需配备体视显微镜（解剖显微镜）和光纤照明光源。</td></tr></tbody></table>

样品的制备 黑腹果蝇 采用悬滴法进行活体成像的胚胎制备

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

基于绿色荧光蛋白（GFP）的延时活体成像技术是研究组织形态发生、细胞间黏附或细胞死亡等动态过程的遗传调控机制的有力手段。表达GFP的果蝇胚胎可方便地通过体视显微镜或共聚焦显微镜进行成像。任何活体成像实验方案的目标都是尽量减少脱水和缺氧等不利影响。以往用于准备果蝇胚胎以进行活体成像分析的实验方案通常包括将去壳胚胎置于卤代烃油中，并将其夹在一层可透过卤代烃气体的透气膜与盖玻片之间。1-3. 以这种方式通过封片压缩胚胎引入了压力，这为任何基于生物力学的形态发生分析带来了不希望出现的复杂性。我们的方法称为悬滴法，可在活体成像过程中保持胚胎极佳的存活率，且无需对胚胎施加压缩。简而言之，悬滴法涉及将胚胎置于一滴悬浮在盖玻片下方的卤代烃油中，而该盖玻片则固定于湿润培养 chamber 上方。这种装置除了可实现气体交换并防止脱水外，还利用了胚胎在卤代烃油中的浮力，防止其在延时成像过程中发生位置漂移。本视频详细介绍了如何利用悬滴法收集和制备果蝇（Drosophila）胚胎以进行活体成像。该方案适用于对去壳胚胎使用体视显微镜或任何直立型复合荧光显微镜进行成像。

本文介绍了一种简单、经济且有效的果蝇胚胎活体成像样品制备方法。我们的实验方案可维持湿度并实现气体交换，且不会压迫果蝇胚胎。该方法适用于在体视显微镜或直立型复式显微镜下对表达GFP的果蝇胚胎进行活体成像分析。

基于绿色荧光蛋白（GFP）的延时活体成像技术是研究动态过程遗传调控的有力方法，例如……

大家好，我是布鲁斯·里德（Bruce Reed），加拿大安大略省滑铁卢市滑铁卢大学生物系的助理教授。今天我们制作这个视频档案，旨在记录我们开发的一种用于制备软体胚胎以进行活体成像分析的新技术。在使用果蝇胚胎进行活体成像分析时，我们经常采用延时成像技术，该过程可能持续数小时。因此，建立一种能够防止胚胎脱水和缺氧的技术显得尤为重要。此外，我们还希望开发一种能够避免对胚胎产生任何压迫的技术。在样品制备过程中，我们开发出一种非常简单、廉价且高效的方法，称为悬滴法。悬滴法适用于利用体视显微镜或任何直立型复式显微镜对活体胚胎进行成像分析。这段延时录像展示了采用悬滴法制备的八个表达绿色荧光蛋白（GFP）的胚胎，并通过延时荧光显微镜成像。此成像序列涵盖了超过四个小时的持续时间。运动的开始表明这些胚胎处于可存活状态。接下来，我们将为您详细逐步介绍如何进行悬滴法实验操作。在标准的葡萄汁、卵或培养皿上收集胚胎。使用 Fly max 科学仪器公司的自动化 FLA 卵收集器，该自动化收集器可提供处于预定发育阶段的同步化胚胎收集。在准备手工处理胚胎前，将一段双面胶带粘贴到显微镜载玻片上，并撕去胶带的背衬。悬滴实验方案需要使用一块厚度为五毫米的聚碳酸酯塑料板自制培养室。将该塑料板切割成显微镜载玻片的尺寸，并用旋转刀具切出一个深度为三毫米的凹槽。通过将一片裁剪至合适大小的组织纸放入培养室的凹槽中，并用蒸馏水浸润，从而实现活体成像培养室的湿度控制。卤代烷油（Halo Carbon oil）非常适合用于活体成像协调发育的果蝇胚胎，因为它具有透气性且光学透明。将700系列和56系列的卤代烷油按1:1比例混合，可获得适用于果蝇胚胎操作的适宜黏度。可使用珠宝镊子或极细的画笔从葡萄汁琼脂平板上收集胚胎。胚胎会相互粘连，并粘附在镊子尖端。它们很容易聚集成团，形成成团的胚胎。粘附在镊子上。将吸头轻轻下压，接触此前制备好的装饰载玻片上胶带的黏性表面。在体视显微镜下观察胚胎的同时，用镊子侧面轻轻推动或轻拂胚胎，务必打开冠状层，但不可破坏内部的绒毛膜。这需要稳定的手法、耐心以及一些练习。一旦外层冠状结构破裂，去氯化的胚胎容易粘附在镊子上。注意不要让去氯化的胚胎接触到胶带的粘性表面。将去氯化的胚胎快速从胶带上取下并转移到封片上的石蜡油滴中可能会非常困难。建议将石蜡油滴放置在附近。用镊子尖轻轻接触封片上石蜡油滴的表面即可。将胚胎从镊子上移入油滴中，可通过肉眼观察确认胚胎的转移，方法是在黑色背景下使用以倾斜角度设置的光纤照明光源，在对下一个胚胎进行氯化处理前完成此步骤。由于镊子在卤代烷油中具有浮力，因此擦拭掉镊子上的油是有帮助的。协调好的胚胎会漂浮在油滴的表面。通过将胚胎推至油滴底部，并在悬滴法中快速翻转盖玻片，我们可以控制胚胎的位置和方向。我们将盖玻片翻转至活体成像培养皿的加湿孔腔上方。当盖玻片被翻转后，胚胎将贴附于盖玻片的下表面。可在体视显微镜下检查胚胎的静止位置。若位置不理想，可重复操作。一旦胚胎处于理想位置，即用胶带将盖玻片固定在活体成像室上。通过在胶带上打孔使腔室通风。胚胎现已准备好进行成像。

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编制果蝇实时成像的胚胎使用悬滴协议

活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

准备个体 果蝇 用于活体成像的卵室

动粒是纺锤体组装检查点（SAC）启动信号、监控姐妹染色单体有丝分裂分离的位点。本文介绍了一种利用徕卡激光扫描共聚焦系统，在Drosophila胚胎中可视化动粒蛋白招募与周转过程，并将其与染色体运动进行协调分析的方法。...

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

本视频介绍了如何对活体黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行显微注射，以将试剂导入其中。研究人员可在胚胎发育早期利用该方法引入外源性物质，如核酸和蛋白质。本视频展示的实验方案详细演示了如何准备并实施可溶性试剂的注射操作——此处以用于活体成像实验的荧光蛋白为例。...

活体显微注射 果蝇 胚胎：向发育中胚胎早期递送试剂

本文介绍了一种研究凋亡细胞清除动态过程的有效方法 体内. 该方法采用活体 果蝇...

活体成像凋亡细胞清除过程 果蝇 胚胎发生

本方案介绍了一种高效成像活体样本的方法 果蝇...

活体成像 果蝇 蛹期复眼

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

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晚期胚胎的解剖与活体成像 果蝇 性腺

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

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本方案描述了定制的基于抗体的荧光标记及其向早期Drosophila胚胎中的显微注射，以实现对低丰度蛋白或翻译后修饰的活体成像，这些目标分子使用传统的GFP/mCherry标签方法难以检测。...

在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

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