一种高通量全局研究酿酒酵母细胞器形态的方法

该实验步骤首先通过培养一排细胞并将其点种到新鲜平板上，制备含有CP1-GFP的菌株阵列。同时，制备一份新鲜的DMA。接下来，将CP1-GFP菌株阵列与DMA进行杂交，并筛选双倍体子代，随后将双倍体细胞转移至孢子形成培养基中诱导减数分裂产生孢子。

五天后，将孢子后代接种于LRK培养基上萌发，只有MAT A单倍体细胞能够生长。经过两轮额外的筛选，我们获得同时携带ACP1-GFP和在卡那霉素抗性基因上敲除目标基因的单倍体细胞。最后，可直接从平板上挑取单个菌株，并通过共聚焦显微镜观察线粒体形态。

大家好，我是来自不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所细胞与发育生物学系 Law 实验室的 Chap T。大家好，我是 Jesse Chao，也来自 Loan 实验室。今天我们将向您展示一种利用机器人系统在酵母的不同突变背景下高效整合 GFP 标记的高通量方法。

我们在实验室中使用此方法研究细胞器（如D、内质网和线粒体）的形态。现在开始操作。本实验方案中，我们使用两种不同的酵母菌株。

ACP1-GFP 是一种在 ACP1 蛋白的 C 末端融合了 GFP 标签的菌株，通过使用质粒 PKT128 介导的 PCR 同源重组技术构建而成。该菌株的遗传背景为 BY7043。我们还使用 DMA 菌株或基因敲除突变体阵列，该阵列包含约 5,000 个非必需基因的敲除突变体。

所有这些非必需基因均在 G418 上被敲除。该阵列的菌株背景为 BY4741。首先，将过夜培养的 ACP1-GFP 菌液取 5 毫升涂布于含组氨酸的平板，以起始 ACP1-GFP 细胞的培养。

将平板在火焰上或生物安全柜中充分干燥。干燥后，将平板于30摄氏度培养过夜。培养结束后，使用机器人将A CP one GFP菌株以每板1,536个菌落的形式进行点样。

同时，通过复制针印将四块18块YPD培养基上的菌株制备新鲜的DMA。随后，在菌株生长后，将培养皿置于30°C条件下过夜培养。通过复制针印和将菌落覆于YPD平板上，制备A CP1 GFP菌株与DMA的组合，然后将平板在30°C下过夜培养。

孵育复制平板后，将SD hiss G四18平板上的菌落用于筛选已铺展的细胞，并在30摄氏度下过夜培养。为了启动第一次复制平板的孢子形成和萌发过程，需将二倍体细胞复制到YPD G四18平板上，以提高下一步孢子形成的效率。在30摄氏度下孵育一天后，将二倍体细胞复制到增强型孢子形成培养基（Sporulation media）上，该培养基含有较低浓度的碳源和氮源，以诱导减数分裂孢子的形成。

接下来，将平板在25摄氏度下孵育至少五天。孵育后，通过将菌落复制接种到LRK培养基上，使菌丝体萌发产生有丝分裂后代。该培养基可诱导孢子中的囊状细胞萌发，将平板在30摄氏度下孵育两天，以筛选同时携带GFP等位基因和单突变等位基因的细胞。

将Mat a细胞在Lade G418培养基上进行复制平板接种，该培养基用于筛选携带基因缺失的单倍体细胞，在30°C下孵育过夜。接着，将Mat a减数分裂子代复制接种到L-H-R-K-G418培养基上，以筛选能够生长的单突变体，且这些突变体同时含有ACP1-GFP，在30°C下孵育过夜。

平板可在 4 摄氏度下保存长达三个月。为了直接从平板上观察表达 CP 一 GFP 的目标突变体，首先从平板上挑取目标菌落。在 30 摄氏度的 YPD 或 SD hiss 培养基中将细胞培养至对数生长早期。

最后，使用共聚焦显微镜的 GFP 滤光片组观察突变体。在此共聚焦图像中，利用 ACP1-GFP 标记物通过共聚焦显微镜观察了突变体与野生型，以研究线粒体形态。该特定突变体表现出线粒体表型异常，因此是进一步研究的良好候选。我们已向您展示了如何通过机器人系统，将多克隆标记物 ACP1-GFP 高效地整合到基因缺失突变体阵列中。

进行此操作时，重要的是要新鲜配制培养基，并确保放置区域有足够时间干燥。如果过于潮湿，会产生冷凝水，增加污染风险。此外，应仔细检查所有筛选培养基是否正确配制，因为它们对本实验方案至关重要。

该方法也可用于其他类型的标记物。例如，为了观察er，我们常规使用标记物air 11和GSP。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。