Name: 一种高通量的方法，在全球范围内研究在酿酒酵母中的细胞器形态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 了解一种高通量方法，用于在酿酒酵母中整合细胞器GFP标记以研究线粒体、内质网等细胞器形态。该方法通过机器人系统实现约5000个非必需基因缺失突变体的高效筛选，显著缩短遗传筛选时间。

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本研究得到了生物技术和生物科学研究理事会（资助号 31/C15982）、加拿大卫生研究院、加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金、迈克尔·史密斯健康研究基金会（C.J.R. Loewen 获资助）以及 Fight For Sight 的支持。

材料与方法：
<ol>
<li>酵母菌株： 
<ul>
<li>Acp1-GFP（GFP::His）：通过使用质粒pKT128（含有GFP和His标签）进行PCR介导的同源重组，实现Acp1的C末端GFP标记。 HIS5阳性转化子通过共聚焦显微镜和菌落PCR确认。菌株背景为Boone实验室提供的BY7043（MAT alpha can1∆::STE2pr-lue2 lyp1∆ his3∆1 leu2∆0 ura3∆0 met15∆0）（Tong和Boone，2006）。</li>
<li>缺失突变体阵列（DMA）（xxx::KanR）：该阵列包含约5,000个非必需基因的缺失突变体，所有非必需基因均在G418抗性条件下被敲除。该阵列的菌株背景为BY4741（MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0）。我们的DMA最初来自Boone实验室。</li>
</ul>
</li>
<li>在DMA中整合Acp1-GFP：
 以下构建GFP阵列的实验方案改编自合成遗传分析（Synthetic Genetic Analysis, SGA）技术（Tong和Boone，2006），并进行了修改。所有复制点样步骤均使用Singer ROTOR高密度阵列机器人系统完成。也可选用手工点样或基于液体处理的高密度阵列机器人系统。 缩写：YPD，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖；SD，合成完全缺失培养基；LRK，亮氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基；LHRK，亮氨酸/组氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基 准备
<ol>
<li>在YPD平板上倒入5 ml过夜培养的Acp1-GFP菌液，形成均匀菌苔。将平板置于火焰旁或生物安全柜中，充分干燥。</li>
<li>在30˚C下过夜孵育平板。</li>
<li>使用机器人将 Acp1-GFP 菌株以每板 1536 个菌落的形式点样到平板中。同时，通过复制针印迹法将 DMA 转移至 YPD + G418 平板，制备新鲜的 DMA 复制板。</li>
<li>在30˚C下过夜培养平板。 
交配与二倍体筛选 </li>
<li>将 Acp1-GFP 菌株与 DMA 通过复制针印迹法在 YPD 平板上进行菌落交配。</li>
<li>30˚C下孵育平板过夜。</li>
<li>将菌落复制接种到 SD – His + G418 平板上，以筛选二倍体细胞（MATa/MATalpha）。</li>
<li>在 30˚C 下孵育平板过夜。 
孢子形成与萌发 </li>
<li>将二倍体菌落影印接种到平板上 增强型产孢培养基，其中碳源和氮源含量较低，以诱导减数分裂孢子的形成。</li>
<li>将培养板在25˚C下孵育至少5天。</li>
<li>通过将菌落复制平板接种到YPD培养基上，使MATa减数分裂子代萌发 LRK 培养基 在30˚C下孵育平板两天。</li>
<li>该培养基将诱导单倍体细胞从孢子中萌发。由于 LUE2 开放阅读框（ORF）被整合至特异于MATa的STE2启动子中，因此所有萌发的单倍体均为MATa型。 
等位基因的双重选择 </li>
<li>现在需要同时筛选出GFP等位基因和单突变等位基因。为此，将MATa细胞复制接种到 LRK + G418 培养基，用于筛选携带基因缺失（xxx::kanR）的单倍体细胞。</li>
<li>在30˚C下过夜培养平板。</li>
<li>最后，将 MATa 减数分裂子代通过影印接种法转移至 LHRK + G418 培养基 用于筛选携带 Acp1-GFP（GFP::His）的单突变体（xxx::kanR）生长。这些平板可在 4˚C 保存长达 3 个月。</li>
</ol>
 以下构建GFP阵列的实验方案改编自合成遗传分析（Synthetic Genetic Analysis, SGA）技术（Tong和Boone，2006），并进行了修改。所有复制点样步骤均使用Singer ROTOR高密度阵列机器人系统完成。也可选用手工点样或基于液体处理的高密度阵列机器人系统。 缩写：YPD，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖；SD，合成完全缺失培养基；LRK，亮氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基；LHRK，亮氨酸/组氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基 准备
</li>
<li>显微镜技术<ol>
<li>直接从平板上挑选表达 Acp1-GFP 的目标突变体。</li>
<li>在 YPD 或 SD – His 培养基中，于 30 °C 培养细胞至对数生长期初期。</li>
<li>使用GFP滤光片通过共聚焦显微镜观察。预期结果示例见图1。</li>
</ol></li>
</ol>
SGA 培养基：
本实验方案中使用的生长培养基（YPD）和筛选培养基（SD）在酵母分子生物学中常规使用。详细描述请参见Methods in Yeast （Amberg 等，2005）。
LRK、LHRK 培养基（共 400 ml）
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>按顺序添加</td>
<td>用量</td>
</tr>
<tr>
<td>含硫酸铵的酵母氮源基础培养基</td>
<td>2.7 g</td>
</tr>
<tr>
<td>氨基酸混合物</td>
<td>0.8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>琼脂</td>
<td>8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
<td>360 mL</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">高压灭菌</td>
</tr>
<tr>
<td>20 % 葡萄糖</td>
<td>40 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">冷却至 65˚C</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml 刀豆氨酸</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml 硫代赖氨酸</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">混匀，每皿倒入 50 ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>
LRK、LHRK + G418 培养基（共 400 ml）
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>依次加入</td>
<td>量</td>
</tr>
<tr>
<td>不含硫酸铵的酵母氮源基础培养基</td>
<td>0.7 g</td>
</tr>
<tr>
<td>氨基酸混合物</td>
<td>0.8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>谷氨酸钠</td>
<td>0.4</td>
</tr>
<tr>
<td>琼脂</td>
<td>8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
<td>360 mL</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">高压灭菌</td>
</tr>
<tr>
<td>20 % 葡萄糖</td>
<td>40 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">冷却至 65˚C</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml 刀豆氨酸</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml 硫代赖氨酸</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>200 mg/ml G418</td>
<td>0.4 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">混合，每皿倒入 50 ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>
富集孢子培养基（共400 ml）
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>依次加入</td>
<td>量</td>
</tr>
<tr>
<td>乙酸钾</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>酵母提取物</td>
<td>0.4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
<td>0.2 g</td>
</tr>
<tr>
<td>孢子形成氨基酸混合物</td>
<td>0.04 g</td>
</tr>
<tr>
<td>琼脂</td>
<td>8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
<td>360 mL</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">高压灭菌</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">冷却至 65˚C</td>
</tr>
<tr>
<td>200 mg/ml G418</td>
<td>0.4 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">混合，每皿倒入 50 ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

该方法可高效地将线粒体标记物 Acp1-GFP 引入多种突变背景中。该方法依赖于机器人系统的使用，且可轻松适配于任何机器人系统。&nbsp;本实验流程也可用于引入其他类型的标记物。例如，为观察内质网，我们常规使用标记物 Erg11-GFP。在我们的代表性图像中，通过共聚焦显微镜观察携带 Acp1-GFP 标记物的突变株和野生型菌株，以研究线粒体形态。该突变株表现出线粒体表型异常，因此是进一步研究的良好候选对象。

<table><tbody><tr><td>SGA 培养基</td><td></td><td></td><td>本实验方案中使用的生长培养基（YPD）和合成缺陷型培养基（SD），包括 LRK 和 LHRK，以及富集型产孢培养基，均为酵母分子生物学研究中常规使用的培养基。详细描述请参见《酵母实验方法》（Amberg 等，2005）。</td></tr></tbody></table>

一种高通量全局研究酿酒酵母细胞器形态的方法

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

高通量方法用于检测蛋白质定位或细胞器形态，是研究蛋白质相互作用的有效工具，有助于全面理解分子通路。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，随着非必需基因敲除文库的发展，我们可以在不同基因背景下利用GFP（或其变体）标记，全局性地研究内质网（ER）和线粒体等不同细胞器的形态。然而，将GFP标记逐一引入各个单基因突变体中是一个劳动密集型过程。本文描述了我们实验室常规使用的一种方法：通过使用机器人系统处理高密度酵母阵列并结合药物筛选技术，可显著缩短实验时间并提高可重复性。简言之，我们利用机器人复制针印技术，将带有GFP标记的线粒体标记物（Apc1-GFP）与包含4,672个非必需基因敲除突变体的高密度阵列进行杂交。通过二倍体筛选、孢子形成、萌发及双标记筛选，我们获得两个等位基因。结果表明，每个单倍体单基因突变体均在其基因组位点整合了Apc1-GFP。由此，我们可在所有非必需基因突变背景下研究线粒体形态。利用这一高通量方法，我们能够在全基因组范围内便捷地研究并阐明参与细胞器遗传与形成的通路及相关基因。

关键词：高通量方法，蛋白质定位，细胞器形态，酿酒酵母，非必需基因敲除文库，GFP标记，线粒体，Apc1-GFP，机器人系统，药物筛选，全基因组分析

GFP融合蛋白被广泛用于通过共聚焦显微镜观察细胞器。然而，筛选影响细胞器形态的突变通常需要单独进行诱变，耗时较长。在此，我们展示了一种方法，可将细胞器-GFP标记物同时整合到酵母中近5000个非必需基因中。

高通量方法检测蛋白质定位或细胞器形态是研究蛋白质相互作用的有效工具，有助于……

该实验步骤首先通过培养一排细胞并将其点种到新鲜平板上，制备含有CP1-GFP的菌株阵列。同时，制备一份新鲜的DMA。接下来，将CP1-GFP菌株阵列与DMA进行杂交，并筛选双倍体子代，随后将双倍体细胞转移至孢子形成培养基中诱导减数分裂产生孢子。五天后，将孢子后代接种于LRK培养基上萌发，只有MAT A单倍体细胞能够生长。经过两轮额外的筛选，我们获得同时携带ACP1-GFP和在卡那霉素抗性基因上敲除目标基因的单倍体细胞。最后，可直接从平板上挑取单个菌株，并通过共聚焦显微镜观察线粒体形态。大家好，我是来自不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所细胞与发育生物学系 Law 实验室的 Chap T。大家好，我是 Jesse Chao，也来自 Loan 实验室。今天我们将向您展示一种利用机器人系统在酵母的不同突变背景下高效整合 GFP 标记的高通量方法。我们在实验室中使用此方法研究细胞器（如D、内质网和线粒体）的形态。现在开始操作。本实验方案中，我们使用两种不同的酵母菌株。ACP1-GFP 是一种在 ACP1 蛋白的 C 末端融合了 GFP 标签的菌株，通过使用质粒 PKT128 介导的 PCR 同源重组技术构建而成。该菌株的遗传背景为 BY7043。我们还使用 DMA 菌株或基因敲除突变体阵列，该阵列包含约 5,000 个非必需基因的敲除突变体。所有这些非必需基因均在 G418 上被敲除。该阵列的菌株背景为 BY4741。首先，将过夜培养的 ACP1-GFP 菌液取 5 毫升涂布于含组氨酸的平板，以起始 ACP1-GFP 细胞的培养。将平板在火焰上或生物安全柜中充分干燥。干燥后，将平板于30摄氏度培养过夜。培养结束后，使用机器人将A CP one GFP菌株以每板1,536个菌落的形式进行点样。同时，通过复制针印将四块18块YPD培养基上的菌株制备新鲜的DMA。随后，在菌株生长后，将培养皿置于30°C条件下过夜培养。通过复制针印和将菌落覆于YPD平板上，制备A CP1 GFP菌株与DMA的组合，然后将平板在30°C下过夜培养。孵育复制平板后，将SD hiss G四18平板上的菌落用于筛选已铺展的细胞，并在30摄氏度下过夜培养。为了启动第一次复制平板的孢子形成和萌发过程，需将二倍体细胞复制到YPD G四18平板上，以提高下一步孢子形成的效率。在30摄氏度下孵育一天后，将二倍体细胞复制到增强型孢子形成培养基（Sporulation media）上，该培养基含有较低浓度的碳源和氮源，以诱导减数分裂孢子的形成。接下来，将平板在25摄氏度下孵育至少五天。孵育后，通过将菌落复制接种到LRK培养基上，使菌丝体萌发产生有丝分裂后代。该培养基可诱导孢子中的囊状细胞萌发，将平板在30摄氏度下孵育两天，以筛选同时携带GFP等位基因和单突变等位基因的细胞。将Mat a细胞在Lade G418培养基上进行复制平板接种，该培养基用于筛选携带基因缺失的单倍体细胞，在30°C下孵育过夜。接着，将Mat a减数分裂子代复制接种到L-H-R-K-G418培养基上，以筛选能够生长的单突变体，且这些突变体同时含有ACP1-GFP，在30°C下孵育过夜。平板可在 4 摄氏度下保存长达三个月。为了直接从平板上观察表达 CP 一 GFP 的目标突变体，首先从平板上挑取目标菌落。在 30 摄氏度的 YPD 或 SD hiss 培养基中将细胞培养至对数生长早期。最后，使用共聚焦显微镜的 GFP 滤光片组观察突变体。在此共聚焦图像中，利用 ACP1-GFP 标记物通过共聚焦显微镜观察了突变体与野生型，以研究线粒体形态。该特定突变体表现出线粒体表型异常，因此是进一步研究的良好候选。我们已向您展示了如何通过机器人系统，将多克隆标记物 ACP1-GFP 高效地整合到基因缺失突变体阵列中。进行此操作时，重要的是要新鲜配制培养基，并确保放置区域有足够时间干燥。如果过于潮湿，会产生冷凝水，增加污染风险。此外，应仔细检查所有筛选培养基是否正确配制，因为它们对本实验方案至关重要。该方法也可用于其他类型的标记物。例如，为了观察er，我们常规使用标记物air 11和GSP。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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