斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

该实验方法可用于高分辨率地确定斑马鱼胚胎中的基因表达模式。将一条反义核糖探针与互补的目标 mRNA 进行杂交。标记的核糖探针可被一种连接了过氧化物酶的抗体识别，随后向胚胎中加入荧光素四（fluoro four）偶联的酪酰胺。过氧化物酶将 IDE 转化为高活性化合物，从而稳定地沉积荧光素四。未结合的 IDE 经洗涤去除，最终揭示 mRNA 分布的精细亚细胞定位模式。

使用带有不同荧光标记的探针和另一种荧光染料，可以观察第二个基因的表达，从而实现对基因表达的详细比较。大家好，我是来自耶鲁大学分子、细胞与发育生物学系 Scott Holly 实验室的 Tim Brent。今天我们将向您展示在本实验室中进行斑马鱼胚胎全 mount 高分辨率双荧光原位杂交的实验步骤。

我们使用此方法研究斑马鱼的体节形成。现在开始操作。从在冷的多聚甲醛中固定过夜的胚胎开始进行该实验步骤。

使用新解冻的多聚甲醛溶液进行此固定步骤对成功染色至关重要。移除固定液，并在室温下用 PBS 洗涤胚胎两次，每次五分钟。接着，去除胚胎的卵壳。

将胚胎置于玻璃凹孔培养皿中。使用钟表匠镊子，从此去除珊瑚绒。用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管转移胚胎。

否则，胚胎会粘附在普通的聚丙烯吸头上。去氯后的胚胎需经过一系列甲醇浓度递增的洗涤步骤。最后一次洗涤使用100%甲醇。

最后，将胚胎置于新鲜的甲醇中，并在零下20摄氏度下过夜保存。第二天，将胚胎依次通过甲醇浓度递减的系列洗涤液进行洗涤，并用PBST缓冲液洗涤两次，每次五分钟。接着，用甲醛固定胚胎20分钟。

用 PBST 洗涤两次，每次五分钟，结束短暂的固定。现在我们已准备好对胚胎进行通透处理。通过将固定后的胚胎与蛋白酶 ACE K 共同孵育，使其具有通透性。务必将微量离心管侧放。

消化步骤的时长取决于胚胎的发育年龄。例如，体节发生阶段的胚胎需在PBST中孵育三到四分钟。用PBST短暂漂洗一次，再用PBST洗涤五分钟。

用多聚甲醛固定胚胎。最后用PBST清洗胚胎两次，每次五分钟。此时胚胎已准备好与RNA探针进行杂交。

在完成胚胎的固定和通透处理后，我们开始进行杂交过程，首先在65摄氏度下用高盐缓冲液（high minus）孵育5分钟。使用前请务必预热HIIN溶液。接着，将胚胎在高盐缓冲液（high plus）中孵育1小时。

再次提醒，需预先将高浓度杂交液预热。现在吸除大部分高浓度杂交液，但保留 50 微升，确保胚胎完全浸没。每种探针各加入 1 微升，并通过轻轻弹动管壁混匀。

从现在开始用铝箔将试管覆盖。由于荧光素对光敏感，需在65摄氏度下避光孵育过夜，以完成杂交。接下来，让我们去除多余的探针。

为了提高染色效果，需去除洗涤剂。但请注意，胚胎在无洗涤剂的情况下会变得黏稠。用50%甲酰胺、2×SSC溶液洗涤两次，每次30分钟。

用1倍XSSC溶液洗涤一次，15分钟。最后，用0.2倍SSC溶液洗涤两次，每次30分钟。接下来，我们将对每个探针进行可视化。

现在我们可以开始检测杂交的探针。首先检测荧光素探针，因为其稳定性及信号强度均低于地高辛探针。首先在室温下用500微升含2%封闭试剂的马来酸缓冲液封闭1小时。

接下来，将辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体以1:500的比例溶于封闭液中加入。在4°C下孵育过夜。务必将微量离心管侧向放置。

接下来，使用酪胺信号放大系统（TSA）开始检测，其中TYROM IDE与荧光素四（fluoro four）偶联。抗体上的辣根过氧化物酶将TY IDE转化为高活性中间产物。该活性TY IDE与抗体附近区域的残基形成共价键，从而导致荧光素四在局部沉积。

首先在室温下用一倍浓度的马来酸缓冲液洗涤四次，每次20分钟，随后用PBS洗涤两次。荧光素TY IDE此前已溶解于DMSO中保存。将此TSA底物短暂离心。

接下来，用扩增稀释缓冲液将TSA底物按1:50稀释。将稀释后的溶液加入胚胎中，孵育45分钟。将微量离心管侧放。

在此孵育步骤中，将胚胎依次经过一系列甲醇浓度递增的10分钟洗涤。最后一次洗涤为在100%甲醇中孵育10分钟，随后在含1%过氧化氢的溶液中孵育30分钟，以灭活抗体上的过氧化物酶。否则，该酶可能会干扰后续对地高辛的检测。

将胚胎依次通过甲醇浓度递减的一系列洗涤液，并用 PBS 缓冲液洗涤两次，每次 10 分钟，以确保完全去除甲醇。地高辛标记探针的抗体杂交步骤始于封闭，方法与之前抗体操作相同。

接下来，加入抗地高辛抗体，按1:1000比例稀释。将微量离心管侧放，在低温环境中过夜孵育。次日，用马来酸缓冲液在室温下洗涤。

然后用PBS快速固定，加入SCI五种酪氨酸底物。将其稀释1:50后加入胚胎中。将离心管侧放，于37℃孵育45分钟。

最后，用PBST洗涤三次。用碘化丙啶进行最终染色以标记细胞核。先用2×SSC溶液洗涤两次，每次五分钟。

接下来，在37摄氏度下用RNAs处理30分钟。在2×SSC溶液中于室温下洗涤六次，然后加入碘化丙啶溶液，染色8分钟。再用2×SSC溶液洗涤六次。

用多聚甲醛固定胚胎 20 分钟。最后，用 PBST 洗涤两次，每次五分钟。胚胎封片观察的步骤首先包括在 25% 和 50% 甘油中分别孵育 10 分钟。

接下来，将样品放入75%甘油中，并在4摄氏度下孵育过夜。这一过夜透明步骤可使胚胎解剖更加容易。最后，解剖并去除胚胎中的卵黄。

为了降低背景荧光，将胚胎平铺在显微镜载玻片上，并在显微镜下观察。这些图像显示了10体节期斑马鱼胚胎后端末端的单个共聚焦切片。红色染色显示的是利用地高辛标记的探针和TSA Cy3试剂检测到的delta C mRNA。

绿色染色表示用荧光素标记的探针检测到的 her one mRNA。TSA 荧光素试剂与碘化丙啶共染的细胞核在双重染色胚胎中呈蓝色。

可以明确确定表达区域是独特还是重叠。该实验步骤揭示了 mRNA 的亚细胞定位，如这些 HER1 染色的局部放大图像所示。基因的活跃转录通过细胞核内染色的点状信号得以显现。

其他细胞则表现出mRNA的细胞质定位。在双重染色的胚胎中，我们可以观察到同时转录两个基因或仅转录其中一个基因的细胞。

此外，我们刚刚向您展示了如何对斑马鱼胚胎进行整体高分辨率双重荧光原位杂交。进行此操作时，重要的是要记住，我们首先使用标准的碱性磷酸酶介导的染色探针来测试探针的效果，能够产生清晰且强信号的探针在荧光原位杂交中表现良好。

我们还成功地使用了β-catenin的免疫定位来替代碘化丙啶染色。当我们进行这种变异时，杂交反应在55摄氏度下进行，而不是65摄氏度。就这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。