Name: 蛋白泛素化的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习检测蛋白泛素化的实验方法，适用于培养细胞和体外体系。本方案通过转染、裂解和免疫沉淀技术，帮助研究者分析泛素连接酶及其底物的功能机制。

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本工作由以下机构资助：美国国立卫生研究院（NIH）基金 RO1 DC006497、RO1 NS057289 和 PO1 ES016738（授予 Z. Zhang）；加州再生医学研究所基金 RS1-00331-1 和 RL1-00682-1（授予 Z. Zhang）；美国帕金森病协会（授予 Z. Zhang 和 Y. S. Choo）；以及迈克尔·J·福克斯帕金森病研究基金会（授予 Z. Zhang）。

检测培养细胞中的蛋白质泛素化
<ol>
<li>用表达目的蛋白及（表位标签版本的）泛素的质粒转染培养的细胞。</li>
<li>配制完全细胞裂解缓冲液（2% SDS，150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 8.0），并加入 2 mM 正钒酸钠、50 mM 氟化钠以及蛋白酶抑制剂。</li>
<li>每孔（6 cm 培养皿）加入 100 µl 裂解缓冲液裂解细胞。若使用更大尺寸的培养皿，按比例调整体积。&nbsp; 轻轻晃动培养皿，使裂解液覆盖所有贴壁细胞区域。</li>
<li>用细胞刮收集细胞，并将裂解物转移至 1.5 ml 离心管中。立即将离心管置于加热板上，煮沸 10 分钟。</li>
<li>使用超声波处理仪对细胞进行剪切。</li>
<li>加入 900 µl 稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1% Triton）。在 4°C 下旋转孵育样品 30–60 分钟。</li>
<li>将稀释后的样品在 20,000 × g 离心 30 分钟。将上清液转移至新的离心管中，注意不要扰动沉淀。</li>
<li>测定蛋白浓度。</li>
<li>在适当的缓冲液中（50% 悬浮液）准备针对目标蛋白的 Protein A-或 G-琼脂糖珠偶联抗体。剪去 P-200 移液枪头的尖端，将 14–20 μl 树脂加入 500–1,500 μg 的细胞裂解物中进行免疫沉淀。对于转染效率较高的细胞，500 μg 裂解物已足够；对于转染效率较低的细胞，可能需要更多蛋白量。</li>
<li>将细胞裂解物与珠粒混合物在 4°C 下旋转孵育过夜。</li>
<li>在 5,000 × g 下离心 5 分钟使珠粒沉淀，吸除上清液。用洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 M NaCl，1 mM EDTA，1% NP-40）洗涤珠粒两次。</li>
<li>最后一次在 20,000 × g 下离心 30 秒，吸除残留洗涤液，加入 2× SDS 上样缓冲液煮沸树脂。</li>
<li>将样品上样至 SDS-PAGE 凝胶，进行免疫印迹分析。</li>
<li>使用相应的抗体检测泛素和目标蛋白。在免疫印迹中，通常先检测泛素信号，随后利用同一张膜检测被沉淀的蛋白。</li>
</ol>
通过靶蛋白泛素化检测 体外 泛素化检测
<ol>
<li>配制5倍泛素化缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 7.5，25 mM MgCl2，2.5 mM DTT，10 mM ATP）。分装成小份，于-20 °C保存，可保存长达6个月。某些实验方案还建议在缓冲液中添加磷酸肌酸和肌酸激酶以实现ATP再生 1,2.</li>
<li>每项反应中，准备如下混合物： 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>8 μl</td>
<td>5X 泛素化缓冲液</td>
</tr>
<tr>
<td>250 ng</td>
<td>泛素化E1</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ng</td>
<td>泛素化 E2</td>
</tr>
<tr>
<td>0.5 μg</td>
<td>泛素</td>
</tr>
<tr>
<td>0.5 μg</td>
<td>目的蛋白</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>加水至终体积为40 μl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
作为对照，分别在缺乏 E1、E2 或泛素的情况下进行类似的反应。</li>
<li>在37°C下孵育混合物1小时或更长时间。</li>
<li>加入SDS-PAGE上样缓冲液终止反应，将样品煮沸10分钟。</li>
<li>将样品上样至SDS-PAGE凝胶，用于免疫印迹分析。</li>
<li>使用相应的抗体检测泛素和靶蛋白。</li>
</ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本演示中，我们首先描述了在培养的哺乳动物细胞中检测目的蛋白泛素化修饰的步骤。为了特异性地检测目的蛋白上的泛素化修饰，而非与之非共价结合蛋白的泛素化，我们采用了严格的细胞裂解、免疫沉淀及洗涤条件1,3。&nbsp; 因此，在如此剧烈条件下对目的蛋白进行免疫沉淀，再通过抗泛素免疫印迹检测到的泛素化信号，很可能特异性地来源于目的蛋白。为防止实验过程中蛋白发生去泛素化，可在所有缓冲液中添加去泛素化酶抑制剂，例如 N-乙基马来酰亚胺和泛素醛4。然而，去泛素化酶在经历10分钟煮沸处理后通常已失活。出现明显的高分子量弥散条带或梯状条带通常是泛素化的典型结果。通过比较不同实验条件下泛素化与未修饰目的蛋白的比值，可评估目的蛋白的泛素化程度。同时，当目的蛋白的泛素化水平升高时，游离泛素分子的量通常会减少。本方案也可用于检测其他类似泛素的小分子修饰，如SUMO化和NEDD化。
我们还描述了一种 体外 使用纯化或重组蛋白进行泛素化检测。市面上有多种带有表位标签的泛素化组分可供选择。泛素连接酶E3对于泛素偶联并非必需。 <em...

蛋白质泛素化检测

Detection of Protein Ubiquitination

泛素化是指多肽泛素共价连接到靶蛋白上的过程，是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰。这三种酶包括泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2 和泛素连接酶 E3。与 E1 和 E2 不同，E3 泛素连接酶具有底物特异性。另一方面，多种去泛素化酶在多泛素化蛋白的加工过程中发挥重要作用。泛素化可导致蛋白质稳定性、细胞定位以及生物学活性的改变。参与泛素化/去泛素化通路的基因突变或泛素系统功能异常与多种人类疾病相关，例如多种类型的癌症、神经退行性疾病和代谢紊乱。检测靶蛋白泛素化水平的异常或正常状态，有助于更深入理解这些疾病的发病机制。&nbsp;本文中，我们描述了在培养细胞中检测蛋白泛素化的方法流程。in vivo和试管in vitro这些实验方案还可用于检测其他类泛素小分子修饰，例如 SUMO 化修饰和 NEDD 化修饰。

泛素化是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰过程。参与该修饰过程的基因突变与多种人类疾病相关。本文中，我们描述了在培养细胞中进行体内（in vivo）以及在试管中进行体外（in vitro）检测蛋白质泛素化的方法。

泛素化是指多肽泛素共价连接到靶蛋白上的过程，是一种由一系列酶介导的关键翻译后修饰……

大家好，我是来自伯明翰医学研究所Jo实验室的Chu。今天我们将向您展示一种检测蛋白质新生定位的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于研究Parkin或UBI3连接酶及其底物。那么，让我们开始吧。首先，用表达目标蛋白和带有表位标签的泛素的质粒共转染细胞。让细胞培养约40小时后，移至实验台进行操作：吸除培养液，并用PBS洗涤细胞两次。随后，向每个六厘米培养皿中加入100微升细胞裂解缓冲液（含2% SDS），裂解细胞。轻轻晃动每个培养皿，使缓冲液完全覆盖细胞。接着，使用细胞刮刀收集裂解后的细胞，并将其转移至1.5毫升离心管中。立即将离心管置于加热块上，煮沸裂解后的细胞10分钟，以进一步变性并溶解蛋白质。煮沸后，使用超声处理装置对细胞及其DNA进行剪切。此步骤可降低细胞裂解液的黏度。超声处理后，加入 900 微升稀释缓冲液，将样品置于 4 摄氏度下旋转孵育 30 至 60 分钟。孵育结束后，在 4 摄氏度下以 20,000 ×g 离心 30 分钟，以获得可溶性蛋白。然后小心不要扰动沉淀，将上清液转移至新的离心管中。最后，通过某种方法（例如本实验所采用的改良Lowry法）测定上清液中的蛋白质浓度。现在，您已准备好使用免疫沉淀法从上清液的其他蛋白质中分离出目标蛋白质。免疫沉淀的第一步是准备与针对目标蛋白质的抗体偶联的磁珠。可以使用市售的抗体偶联磁珠，或利用交联剂自制固定化抗体。如本实验所示，在相容的缓冲液中制备固定化抗体，配制成50%的悬液，用于进行氨基沉淀反应。剪去P200移液枪头的尖端，将14至20微升树脂转移至500至1500微克的制备细胞裂解液中。根据您所用细胞的转染效率调整细胞裂解液的用量。将细胞裂解液与珠粒的混合物置于4°C条件下旋转孵育过夜。在此期间，与珠粒偶联的抗体将特异性结合您的目标蛋白。第二天，在 4°C 条件下以 5,000 × g 离心 5 分钟，使蛋白质沉淀。此时蛋白质已结合在磁珠上，吸除上清液，并用高盐洗涤缓冲液将树脂洗涤两次，每次在 5,000 × g 离心 5 分钟。最后在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 30 秒，吸除残留的洗涤缓冲液。现在您已经纯化了目标蛋白，接下来需要在SDS-PAGE凝胶上进行蛋白电泳。首先，将珠子树脂与两倍体积的SDS上样缓冲液混合并煮沸，以使蛋白质变性并赋予其负电荷。然后将制备好的样品上样到SDS-PAGE凝胶中。使用您实验室的蛋白质印迹（western blotting）方案，将凝胶中的蛋白质转移到膜上。随后使用抗泛素或目的蛋白的抗体孵育该膜，并在胶片上显影以观察泛素化蛋白。我们刚刚向您展示了如何在培养细胞中检测蛋白质的泛素化。该实验同样可以在试管中进行体外反应。此反应总体积为40，可在PCR管中进行。按如下步骤准备每个反应。首先，加入五倍体积的泛素化缓冲液，其中含有 TP 和还原剂二硫苏糖醇（DTT）。接着，加入泛素化酶 E1 和 E2。然后加入底物、泛素以及靶蛋白。用水补足总体积至40微升作为对照。制备不含泛素E1、E2或靶蛋白的类似反应体系。将反应混合物在37摄氏度下孵育1小时或更长时间。加入SDS-PAGE上样缓冲液终止反应，将样品煮沸10分钟。将样品上样至SDS-PAGE凝胶，并按照体内实验的方法进行免疫印迹分析。以下是该实验方案的一个示例结果。Parkinson（帕金森蛋白）是一种与帕金森病相关的蛋白，此处为本实验关注的目标蛋白。第四泳道显示了被泛素化的帕金森蛋白。在未经修饰的帕金（parin）分子量上方显示典型的强条带或梯状条带，用于比较不同实验条件下的结果，同时需考虑各条件下未经修饰的靶蛋白帕金以及泛素的细胞表达水平。此图为体外帕金泛素化实验示例：经亲和纯化的帕金用于体外泛素化检测，在存在重组E1、E2及生物素标记泛素的条件下反应，通过链霉亲和素-HRP检测生物素标记的泛素化帕金。泛素化的帕金在未经修饰的帕金分子量上方呈现梯状条带；泳道一、二和四为对照组，分别缺少泛素、E1和E2以及帕金。我们刚刚向您展示了如何在培养的细胞中检测新疫苗接种后的蛋白质。在进行此操作时，重要的是要记住在强变性条件下制备细胞裂解液，并在加入偶联抗体之前对细胞裂解液进行稀释。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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