大鼠脑组织聚集体培养物的制备用于神经元与胶质细胞发育研究

我们介绍一种用于培养中枢神经系统神经前体细胞的系统，这些细胞在发育过程中会分化为成熟的神经元和胶质细胞。该实验流程始于分离4个E16大鼠胚胎的脑组织，并用胰蛋白酶进行消化。将组织处理成单细胞悬液，经过滤、计数后，接种于六孔板中。

将孔板中的细胞每天轻柔重悬一次，持续两到三天，以促进聚集体形成。随后收集聚集体，通过200微米孔径的滤网筛分，并通过洗涤去除小团块和细胞碎片。最后，对聚集体进行计数，并接种至包被有Matrigel的盖玻片上。

大家好，我是来自德克萨斯农工大学兽医综合生物科学系约翰·L博士实验室的Coto。今天我们将向您展示一种脑类器官培养的方法。我们在三级实验室中使用该方法研究内皮细胞谱系、细胞发育以及细胞间的相互作用。

那么我们开始吧。在开始之前，请准备好实验台上的灭菌工具、70%乙醇、用于操作的垫巾，以及盛有冰上放置的培养基的10厘米培养皿。

在通风橱内，准备一台体视显微镜，配备冰上平台，并将数个盛有冰上解剖液的10厘米培养皿置于冰上。最后，配制好后续使用的各种溶液，并将铺板培养基在37摄氏度水浴中预热。本实验方案首先从Sprague dolly大鼠中获取胚胎发育第16天（E16）的胚胎。

首先，根据所在机构动物护理与使用委员会批准的程序，对一只怀孕雌性大鼠实施安乐死。将已安乐死的大鼠置于尿垫上，并用酒精喷洒其腹部以进行清洁。接着，用镊子夹起腹部皮肤，另一只手使用剪刀仅剪开皮肤，将皮肤分开后，换用另一套灭菌的镊子和剪刀剪开肌肉层。

接下来，取出子宫并转移至含有冰上预冷的解剖培养基的10厘米培养皿中。下一步在生物安全柜中使用显微解剖剪进行。小心地将每个胚胎从子宫中分离出来。

现在可以开始收获并进行操作。处理胚胎脑组织时，从每个胚胎中取出脑组织，并将分离出的脑放入置于冰上、盛有解剖液的洁净10厘米培养皿中。在解剖显微镜下完成脑组织的解剖。

去除中脑和后脑部分。使用精细镊子去除脑膜，将剩余的前脑组织转移至含有解剖液的50毫升离心管中。此时组织已准备好进行下一步操作。

通过酶消化法解离细胞。在准备开始消化前，配制新鲜的丙烷和胰蛋白酶抑制剂过滤溶液，经灭菌后置于水浴中加热至37摄氏度。

去除解剖后脑组织中多余的培养基。然后向50毫升离心管中加入4毫升已配制好的丙烷消化液。将离心管置于37°C水浴中，准确孵育5分钟。

时间到达后，使用移液器移除丙烷溶液。接着，加入 5 mL 新鲜配制的胰蛋白酶抑制剂溶液，并将试管重新放入 37 °C 水浴中继续孵育 2 至 3 分钟。时间到达后，移除胰蛋白酶抑制剂溶液。

用胰蛋白酶抑制剂溶液再重复孵育三次。最后一次去除胰蛋白酶抑制剂溶液后，向试管中加入 20 毫升温热的铺板培养基 pm。

现在需要进行细胞重悬和洗涤。使用10毫升移液器反复吹打细胞约20至30次，直至所有细胞团块完全消失。然后在100 ×g下离心7分钟。

此时，您的细胞应已彼此充分分离。七分钟后，弃去上清液，将沉淀重悬于 10 毫升铺板培养基中以洗涤细胞。

然后再次离心。弃去上清液，并重复洗涤和离心步骤。第二次洗涤后进行下一步。

将沉淀重悬于10毫升聚集培养基中，通过70微米细胞筛过滤细胞，最后使用血细胞计数板计数活细胞。

现在，您可以开始让解离的脑细胞形成聚集体。计数后，将解离的细胞重悬于聚集体培养基中，密度为每毫升2×10⁶个细胞。将2毫升细胞悬液转移至未包被的6孔板的每个孔中。

每天晚上将细胞轻轻重悬三次。使用 P1000 移液器操作后，细胞将在集落铺板当天开始形成聚集体。细胞培养三个晚上后，再次轻轻重悬细胞，并将细胞悬液通过 200 微米滤网转移到 50 毫升 Falcon 管中。

让聚集体在离心管底部静置约三到五分钟。然后小心吸去上清液，加入培养基，轻柔重悬聚集体，并再次让其沉降。重复此操作数次。

为了去除死细胞、单个细胞和碎片，使用显微镜检查上清液中是否仍含有未聚集成团的细胞和碎片。在充分洗涤聚集体后，将其轻轻重悬于相同的培养基中，并对聚集体进行计数以确定其浓度。随后将聚集体的密度调整至每50微升含25至30个聚集体左右。

现在需要将聚集物接种到盖玻片上。将1000微升的聚集物悬液分装至2毫升的Eppendorf管中，由于聚集物容易沉降到管底，因此必须制备多管聚集物悬液以用于后续铺板。本步骤所用的盖玻片需预先涂布细胞培养基质Matrigel，并在37摄氏度下孵育过夜。

在制备好总悬浮液的Alec watts后，将含有包被Matrigel的盖玻片的培养板从培养箱中取出。移除每个孔中的溶液，用预热的PBS洗涤盖玻片，然后用DD H2O洗涤。

现在可以进行聚集体接种，将聚集体接种到盖玻片上。轻轻颠倒聚集体悬液管以混匀并使聚集体均匀分布。然后取50 µL聚集体悬液加入每张盖玻片的中央。

轻轻将培养板放回培养箱，避免进一步干扰，以使聚集体均匀附着在盖玻片上。聚集体的密度至关重要，若聚集体之间距离过近或接种密度过高，在初始接种后四到六小时的生长过程中，它们容易相互融合。向每个孔中加入 500 µL 培养基。

为了维持聚集体培养，每三到四天更换一半的培养基。更换培养基时，应沿培养孔的侧壁缓慢加入，以避免扰动聚集体。在聚集体附着于盖玻片数小时后，即可观察到从聚集体中延伸出的神经突起。

在前两周内，轴突迅速生长，并在类器官之间形成丰富的连接。胶质前体细胞从类器官向外呈放射状迁移，并随时间推移分化为星形胶质细胞和成熟的少突胶质细胞。我们刚刚向您展示了如何培养脑类器官。

进行此操作时，重要的是要正确估算容量，并均匀地观察聚集体。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。