Name: 在子宫内和前体内的基因表达在小鼠视网膜神经节细胞的电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: 学习小鼠视网膜神经节细胞基因表达调控技术，通过子宫内和前体外电穿孔方法实现DNA导入。该技术可研究基因改变对RGC发育及视觉投射通路的影响，为神经科学和发育生物学研究提供重要工具。

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我们感谢理查德·瓦利博士和布里卡·斯特里沙提供的帮助 在子宫内 和 离体 分别感谢视网膜电穿孔技术以及T. Sakurai博士对本方案的评论。本工作由美国国立卫生研究院基金F31 NS051008（T.J.P）、法国医学研究基金会、人类前沿科学计划（A.R.）和R01 EY12736（C.M.）资助。

第1部分：in utero 和 ex vivo 视网膜电穿孔实验的准备工作
1. 对于两者 在子宫内 和 离体 视网膜电穿孔
<ul>
 <li>使用电极拉制仪制备尖端细小的微电极，并打断尖端（或对尖端进行斜面处理）以形成倾斜的尖端。</li>
 <li>将DNA溶液配制为所需浓度，并加入少量Fast Green染料（0.05%）以观察注射过程。我建议 5 μl 每位母亲的DNA溶液 在子宫内 视网膜电穿孔 1 μl 每个胚胎头部对应的DNA溶液 离体 视网膜电穿孔。加入GFP表达载体（或其他荧光蛋白）以可视化转染的神经元。</li>
 <li>通过高压灭菌器对手术器械进行灭菌。</li>
 <li>制备氯胺酮-赛拉嗪麻醉混合液，每只孕鼠配制约 0.2 ml，体积比为 1.0:0.2:4.6 100 μg/ml 氯胺酮：100 μg/ml 赛拉嗪：生理盐水。也可使用其他麻醉剂。</li>
</ul>
2. 对于 在子宫内 视网膜电穿孔
<ul>
 <li>打开加热垫，并用尿布垫覆盖。</li>
 <li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制抗生素-抗真菌素溶液（1:100），并置于加热垫上预热。每只孕鼠准备约 2 ml。</li>
 <li>将经无菌过滤的 PBS 置于温水浴中保温。</li>
</ul>
3. 对于 离体 视网膜电穿孔
 <ul>
 <li>准备用于视网膜孵育的含氧无血清培养基（SFM）：将25 ml DMEM/F12培养基用95%氧气/5%二氧化碳混合气体通气处理至少2小时。向25 ml含氧培养基中加入0.25 g牛血清白蛋白（BSA）、250 μl ITS补充剂和50 μl青霉素-链霉素溶液。混匀使BSA完全溶解，然后经无菌滤器过滤。该溶液需在每次电穿孔实验前新鲜配制。</li>
 <li>准备含0.4%甲基纤维素的SFM培养基用于视网膜外植体孵育：将0.20 g甲基纤维素加入含搅拌磁子的150 ml瓶中，高压灭菌。配制50 ml SFM（方法同上，无需通气），加入已灭菌的甲基纤维素瓶中。在4°C下混合过夜。次日经无菌滤器过滤后于4°C保存，该溶液可保存约1个月。</li>
 <li>在视网膜外植体收获当天（第5部分），准备用于接种视网膜外植体的培养皿：用250 μl多聚-L-鸟氨酸在37°C下包被玻璃底培养皿至少2小时（也可在前一天包被，并于4°C孵育过夜）。用PBS多次洗涤培养皿，然后加入200 μl含10 μg/ml层粘连蛋白（laminin）的DMEM/F12溶液，在37°C下包被至少2小时。再用37°C的PBS多次洗涤培养皿，并保持在PBS中，直至外植体准备接种。</li>
 <li>对于边界实验，先按上述方法用多聚鸟氨酸包被培养皿，然后将培养皿的一半用目的蛋白与荧光标记物共同包被2小时（37°C），以可视化边界（例如使用Alexa Fluor 555标记的BSA，稀释比例1:800）。用PBS洗涤后，再按上述方法加入层粘连蛋白。</li>
 </ul>
第2A部分： 在子宫内 视网膜电穿孔：向E14.5小鼠视网膜注射并电穿孔导入DNA

关键词：视网膜电穿孔，DNA注射，E14.5小鼠视网膜，电穿孔，基因转染，发育生物学，神经发育，视网膜发育 体内
<ol>
<li>向处于 E13.5–E14.5 阶段的母鼠腹腔（i.p.）注射 0.15 ml 麻醉混合液。母鼠通常需要 3–7 分钟达到外科手术麻醉水平。完全麻醉的小鼠在受到后肢足垫夹捏时不应有反应。</li>
<li>在此期间，剪取一小片 Parafilm，并用移液器吸取约 5 µl DNA 溶液滴加到 Parafilm 上。将推杆（金属丝）弯成 90° 角，插入拉制好的微量移液管中。使用推杆将 DNA 溶液吸入微量移液管内（使用解剖显微镜可辅助此操作）。</li>
<li>当母鼠达到外科手术麻醉水平后，使用电动剃毛器剃除其腹部约 2 英寸区域的毛发，随后将其背侧朝下放置于加热垫上。用酒精棉片擦拭剃毛区域，再用碘伏棉片至少擦拭两次，完成术区准备。在每只眼睛上滴加一滴眼科用 Vet 软膏，以防止母鼠在全身麻醉期间发生角膜溃疡。 <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig1.jpg" alt="胚胎视网膜注射过程示意图；DNA-GFP 在视神经通路中的追踪；RGC 分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"></li>
<li>用镊子夹住皮肤，使用剪刀沿腹中线方向（长约约 1 英寸）切开皮肤和肌肉，暴露腹膜。用镊子提起腹膜，并沿相同方向做垂直切口，以暴露腹腔（图 1）。然后用纱布垫覆盖手术区域，防止腹腔内容物接触并被动物毛发污染。</li>
<li>用镊子将皮肤和腹膜向后拉开，使用解剖 spatula 通过切口取出一个胚胎（选择最容易接近的胚胎）。将 spatula 置于两个胚胎之间，轻柔地将胚胎链从腹腔中拉出。也可用手将胚胎链拉出。 
 *自此步骤起，须始终用无菌 PBS 保持胚胎湿润*</li>
<li>将母鼠保持在加热垫上，置于解剖显微镜下，轻柔按摩胚胎，使其视网膜朝上。建议从最内侧或最外侧的胚胎开始操作，以便更清晰地记录哪些胚胎已完成电转染。</li>
<li>用惯用手持微量移液管，另一只手固定胚胎。使用微量移液管穿过子宫壁和羊膜囊刺入视网膜。根据微量移液管的锋利程度，穿透子宫壁可能需要一定压力，但一旦穿透，移液管将进入胚胎并理想地到达视网膜。由于难以控制和判断移液管进入胚胎的深度，因此在刺穿膜结构后应尽量减少移液管的移动，以防扩大穿刺孔，导致羊水泄漏和胚胎死亡。应避免刺破子宫壁中的血管，以免引起出血和胚胎死亡。</li>
<li>当确认微量移液管已进入视网膜后，即可将 DNA 溶液注入视网膜。缓慢推动推杆，同时逐渐撤出微量移液管，确保 DNA 沿移液管路径被注入，因为移液管常深入至视网膜深层。若已定位在视网膜，应将 0.5 μl（可通过移液管上的 1 μl 刻度标记测量）注入视网膜外层与视网膜色素上皮（RPE）之间的视网膜外间隙。应观察到绿色染料填充视网膜，并渗入羊水中（图 1）。</li>
<li>电穿孔电极板在手术期间应保存在盛有 PBS 的培养皿中。轻柔地将电极板置于胚胎头部两侧，正极（+）电极板应位于注射眼的同侧。施加适度压力以固定头部，但切勿用力过猛，以免压破羊膜囊导致胚胎死亡。当电极就位后，以 60 Hz 频率施加 5 次 40 V、50 ms 的方波脉冲。由于电流可能逸散至皮肤和肌肉，母鼠出现轻微抽搐是正常现象。</li>
<li>对每个需要注射和电转染的胚胎重复步骤 7–9。通常每只母鼠电转染 4–8 个胚胎，具体数量取决于 DNA 用量、胚胎数量、母鼠状态及麻醉时间。也可选择先集中注射多个胚胎，再统一进行电转染，而非逐个完成注射与电转染。</li>
<li>完成胚胎电转染后，使用镊子和 spatula 将胚胎链重新放回腹腔。向腹腔内注入约 2 ml 抗生素-抗真菌溶液。</li>
<li>使用止血钳和镊子缝合腹膜，从切口前段打双结开始，采用连续简单缝合方式缝至切口后段。最后以打结固定缝线，并剪除多余线头。</li>
<li>为闭合切口进行缝合钉固定时，用钝头镊子提起切口前段的皮肤，注意将皮肤与腹膜分离。将缝合钉器的齿部环绕皮肤放置并按压钉合。沿切口向后端继续钉合，通常需要 5–7 枚缝合钉。用酒精棉片擦拭缝合钉周围的伤口。</li>
<li>让母鼠在加热垫上恢复（通常需 15–90 分钟苏醒），当其开始翻身时，将其腹部朝上放入新笼中。</li>
<li>为减轻疼痛与不适，母鼠在苏醒时接受布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg，s.c.）注射，若后续仍存在不适，可再次给药。为防止脱水，术后约 2–4 小时皮下注射（s.c.）1.0 ml 生理盐水，若当晚或次日仍需补充，可再次注射。术后 24 小时，母鼠应恢复正常行为，并能正常饮水和进食。</li>
</ol>
第2B部分：在体视网膜电穿孔 在E18.5阶段获取电穿孔后的视网膜
<ol>
<li>在 PBS 中配制 4% 多聚甲醛（PFA），每个胚胎约需 5 ml。灌注可使用重力输液系统或注射泵进行。（或者，可将 E18.5 胚胎头部直接浸入 4% PFA 中过夜。）</li>
<li>向母鼠腹腔注射 0.2 ml 麻醉混合液，并确保其完全进入麻醉状态。使用剪刀剪开皮夹下方的皮肤和腹膜，暴露腹腔和子宫角。</li>
<li>取出电穿孔后的胚胎，将其腹侧朝上固定。切开腹部皮肤、腹膜、膈肌以及肋骨的侧部，以暴露心脏。将连接灌注装置的蝶形针头插入左心室，并用显微剪刀剪开右心房。启动灌注，使 PFA 流动约 60 秒；若灌注成功，血液将从右心房流出，胚胎逐渐变苍白。随后将胚胎断头，将头部放入含 4% PFA 的 15 ml 锥形管中。对所有电穿孔胚胎重复此操作。将头部于 4°C 条件下在 4% PFA 中固定过夜，之后在 PBS 中洗涤数天。在所有胚胎收集完毕后，通过颈椎脱臼法处死母鼠。</li>
</ol>
去除视网膜
<ol start="4">
 <li>用 PBS 清洗后，将头部置于解剖皿中，使视网膜朝上，并浸入 PBS 中。去除视网膜周围的皮肤以暴露视网膜色素上皮（RPE）。使用 26G1/2 针头在晶状体与 RPE 交界处刺穿腹侧视网膜。将显微剪的一侧插入该孔中，沿腹侧视网膜垂直剪切至视盘。此切口有助于在取出视网膜时确定其方位。</li>
 <li>用尖头镊子去除 RPE。用一把镊子夹住腹侧切口处的 RPE，另一把镊子从 RPE 与晶状体交界处（RPE 紧密附着的位置）开始剥离 RPE。去除 RPE 后，用精细镊子夹住晶状体，向上提起并取出晶状体。用镊子夹住视神经乳头周围组织，夹断视网膜。将视网膜转移至盛有 PBS 的孔中，并记录每只视网膜来自哪只头部样本。</li>
 <li>对对侧视网膜及其他所有电转胚胎重复步骤 4–5。未注射的视网膜作为免疫染色的对照。</li>
 <li>使用荧光解剖显微镜扫描所有视网膜，检测 GFP+ 细胞（绿色视网膜）。对于所有显示 GFP+ 的视网膜，表明该胚胎的电转成功，这些视网膜及其对应的脑组织（视觉系统完整）可进行后续分析（如切片和免疫染色）（图 1）。</li>
</ol>
第3a部分： 离体 视网膜电穿孔 向E14.5小鼠视网膜注射并进行DNA电穿孔 体外
<ol>
 <li>用 0.2 ml 麻醉混合液对处于 E13.5–E14.5 阶段的母鼠进行麻醉，并确保其完全进入麻醉状态。使用剪刀剪开皮肤和腹腔，暴露胚胎。用镊子提起胚胎链，剪断结缔组织，将整个胚胎链从母体中完全取出。将胚胎链置于含 DMEM/F12 并置于冰上的培养皿中。通过颈椎脱位法处死母鼠。</li>
 <li>用显微剪刀剪开整个子宫壁，然后用镊子将每个胚胎从羊膜囊中取出，并夹除胎盘。将每个胚胎的头部剪下，并收集至另一含有 DMEM/F12 并置于冰上的培养皿中。</li>
 <li>使用口吸移液管或推杆式移液器，将所需量的 DNA 溶液（见第 1 部分）吸入微量移液针中。</li>
 <li>在本实验方案中，DNA 将被注射至视网膜周边背侧区域。通过调整 DNA 注射位点及电极板的位置，也可靶向其他视网膜区域。</li>
 <li>将一个头部转移至含 PBS 的解剖皿中，腹面朝下固定，使头部背侧向上。用镊子去除视网膜上方的皮肤。</li>
 <li>将微量移液针保持在与水平方向约呈 10° 的位置（基本与背侧视网膜曲率平行），将移液针推入视网膜色素上皮层（RPE），使针尖位于 RPE 与外层视网膜之间。向此间隙注入约 0.1–0.4 μl 的 DNA 溶液；绿色液体应可见充满整个间隙并从 RPE 的穿孔处渗出。对对侧视网膜重复注射操作。</li>
 <li>小心而迅速地移除固定针，并（保持头部浸没于 PBS 中）将电极板置于头部两侧，正极（+）电极板置于头部的腹侧。施加 4 次 40 V、50 ms 的脉冲，频率为 60 Hz，然后将头部放回含 DMEM/F12 并置于冰上的培养皿中（图 2）。 <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig2.jpg" alt="电穿孔方法示意图；DNA 注射至视网膜，于 SFM 中培养，显示 GFP+ 外植体。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"></li>
 <li>对所有头部及所有 DNA 溶液重复步骤 5–7。完成所有电穿孔操作后，向 4 孔板中每孔加入约 1.5 ml 预先充氧的 SFM 溶液，并置于冰上（每种不同 DNA 溶液各用一孔）。</li>
 <li>将一个头部转移至含 DMEM/F12 的解剖皿中，使一侧视网膜朝上。在腹侧视网膜（或与靶区域相对的一侧），使用精细镊子夹住并撕开 RPE 形成小孔。将镊子一端插入此孔，从晶状体-视网膜连接处开始剥离 RPE，使其与视网膜分离。注意不要切割或损伤视网膜，以免在孵育过程中导致视网膜塌陷。去除 RPE 后，用镊子在视网膜基底部夹住视神经，将视网膜完整挤出（保持晶状体完整）。将视网膜转移至充氧的 SFM 中。翻转头部，对对侧眼重复上述操作。</li>
 <li>对所有经电穿孔处理的头部完成步骤 9。将视网膜在 37°C 下于充氧的 SFM 中孵育 40–48 小时。</li>
</ol>
第3b部分：离体视网膜电穿孔 电穿孔后2天收获并接种GFP+视网膜外植体
<ol>
 <li>将一个孔中所有含氧的无血清培养基（SFM）中的视网膜转移至含有 DMEM/F12 的培养皿盖中。选择一个视网膜，使用荧光解剖显微镜观察视网膜中 GFP+（绿色）部分。</li>
 <li>使用显微手术刀和镊子，切除并丢弃非 GFP+ 部分的视网膜，仅保留 GFP+ 的视网膜组织块。在整个解剖过程中，交替使用荧光和普通光源有助于准确选择 GFP+ 视网膜。将 GFP+ 视网膜转移至含有 DMEM/F12 的孔中。</li>
 <li>对来自同一孔的所有视网膜重复步骤 2。对于每个 DNA 处理条件（即每个不同的孔），均需使用新的培养皿和 DMEM/F12 培养基。</li>
 <li>现在需将这些 GFP+ 视网膜切割成更小的视网膜外植块用于接种。在解剖显微镜下，使用显微手术刀将较大的 GFP+ 视网膜组织切割为较小的外植块。外植块应呈矩形，长宽约为 200–300 μm。将所有外植块收集至含有 DMEM/F12 的孔中。一个 GFP+ 视网膜组织块通常可产生约 4–10 个 GFP+ 视网膜外植块，具体数量取决于组织大小。对所有已分离的 GFP+ 视网膜区域重复此步骤。</li>
 <li>在完成所有 GFP+ 视网膜外植块的制备后，向经层粘连蛋白包被的培养皿（见第 1 部分）中加入 250 μl SFM + 0.4% 甲基纤维素（保存于 4°C）。将 4–8 个 GFP+ 外植块转移至培养皿中，并使用镊子轻轻将其排列成多边形，使外植块位于培养皿中心与边缘之间的中点位置。</li>
 <li>确定外植块的 RGC 层所在面。有时 RPE 结晶会附着在视网膜外层，表明其对侧即为 RGC 层。此外，RGC 面通常残留一些细胞碎片，有助于正确判断外植块的方向。</li>
 <li>将 RGC 层朝下，用镊子用力按压外植块中心，使其牢固贴附于玻璃盖玻片上。镊子按压后可能在外植块上留下压痕，此现象属正常。</li>
 <li>在所有外植块接种完成后，将培养皿置于 37°C 培养箱中。接种后 4–6 小时可首次观察到视网膜轴突生长，外植块可维持数天健康状态，但 24 小时后可能出现明显过度生长。外植块可用于多种体外（in vitro）检测，可用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 30 分钟后进行免疫染色（图 2）。</li>
</ol>
边界实验
<ol start="8">
 <li>或者，将4个GFP+外植体转移至已为边界实验准备好的培养皿中（参见第1部分）。将外植体排列在培养皿中央的一条垂直线上，位置大致与边界重合。</li>
 <li>在荧光解剖显微镜下，将外植体接种至距离荧光边界约50–150 mm的位置。将培养皿在37°C条件下孵育24小时，以充分允许视网膜神经节细胞（RGC）轴突延伸至边界基质。外植体可用4%多聚甲醛（PFA）固定30分钟，随后进行免疫染色（图2）。</li>
</ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig3.jpg" alt="视网膜GFP可视化；通过子宫内电穿孔标记GFP阳性RGC轴突的示意图，显示视路通路。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3">

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

在本视频中，我们展示了电穿孔技术，包括 在子宫内 和 离体用于将基因递送至小鼠胚胎视网膜神经节细胞。 在子宫内 视网膜电穿孔为调控视网膜神经节细胞（RGCs）基因表达并可视化其轴突投射提供了有效手段 体内让胚胎在出生后存活，可使其GFP+ RGC轴突投射至靶区外侧膝状体核（LGN）的过程得以观察。 离体 视网膜电穿孔技术可更精确地靶向特定视网膜区域，适用于 体外 检测方法。结合 体内 和 体外 这些技术获得的分析结果能够在整体正常背景下，对部分视网膜神经节细胞（RGC）的发育及其轴突投射进行充分表征。尽管我们的演示重点在于视神经交叉处RGC轴突的导向，但两者 在子宫内 和 离体 视网膜电穿孔技术可能有助于研究基因表达扰动对视网膜神经节细胞分化、树突形态、电生理特性、突触形成以及在侧膝状体和上丘等终止区域中的精确投射所产生的影响。

<table><tbody><tr><td>BTX 电穿孔仪 ECM 830（带脚踏开关）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>圆形镊形电极</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 或 CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>带推杆玻璃微量移液管</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITS 添加剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底细胞培养皿</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero 和 ex vivo 电穿孔法用于小鼠视网膜神经节细胞中的基因表达

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

视网膜及其唯一的输出神经元——视网膜神经节细胞（RGC）——是研究细胞分化、轴突导向、视网膜拓扑组织和突触形成等生物学问题的优良模型[1]。一个局限在于难以高效且可靠地调控RGC中的基因表达 体内，尤其是在其他方面易于研究的小鼠视觉通路中。转基因小鼠可用于调控基因表达，但这种方法通常成本高昂、耗时较长，且可能产生非预期的副作用。在鸡胚中，体内电穿孔技术被用于调控视网膜神经节细胞（RGCs）中的基因表达，以研究视网膜和RGC的发育。尽管类似的电穿孔技术已在新生小鼠[2]、成年大鼠[3]以及小鼠胚胎视网膜[3]中建立 体外[4]，但这些策略均无法对RGC的发育及轴突投射进行完整表征 体内为此，我们开发了两种电穿孔技术的应用，一种 在子宫内 以及另一个 离体，以特异性靶向小鼠胚胎期视网膜神经节细胞[5, 6]。 
与 在子宫内 视网膜电穿孔，我们可在视网膜神经节细胞（RGCs）中实现特定基因的异常表达或下调，并追踪其轴突在视觉通路中的投射情况 体内，从而能够在中间靶点（如视交叉）或最终靶区（如外侧膝状体核）处研究轴突导向的决策过程。在整体野生型背景下，特异性干扰部分视网膜神经节细胞（RGCs）中的基因表达，有助于阐明该基因在视网膜通路中的功能。此外，我们还开发了一种配套技术，用于分析RGC轴突的生长情况 体外我们对外植的胚胎头部进行体外电穿孔，收集并培养整个视网膜，数天后从中制备视网膜组织块。视网膜外植块可用于多种体外实验，以检测经电穿孔转染的视网膜神经节细胞（RGC）轴突对导向信号或其他因子的反应。总之，这一系列技术增强了我们在RGC中实现基因错表达或基因下调的能力，将极大促进对RGC发育及轴突投射的研究。

本文介绍了通过胎内（in utero）和离体（ex vivo）电穿孔技术操控小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）基因表达的两种方法。这些技术可用于研究基因表达变化对RGC发育、轴突导向以及功能特性的影响。

视网膜及其唯一的输出神经元——视网膜神经节细胞（RGC）——是研究细胞等生物学问题的优良模型……

在子宫内，视网膜电穿孔操作首先对处于胚胎13.5至14.5天（E 13.5–14.5）的麻醉母鼠进行腹部切口，以暴露胚胎链。将DNA注射到每个胚胎的一个视网膜中，随后对胚胎头部进行电穿孔，使DNA被视网膜神经节细胞（RGC）前体细胞摄取。在胚胎18.5天（E 18.5）时，对胚胎进行灌注并检测GFP阳性细胞。对X体外视网膜电穿孔的视网膜及视觉投射进行分析。将E13.5至E14.5的小鼠头部背侧朝上固定于培养皿中，将DNA注射至双侧视网膜的周边背侧区域，随后进行电穿孔。完整视网膜组织培养40小时，之后将表达GFP的视网膜外植体接种，用于体外培养实验。大家好，我是来自哥伦比亚大学病理学与细胞生物学及神经科学系Carol Mason博士实验室的Tim Petros。今天我们将向您展示如何通过子宫内和离体视网膜电穿孔技术，将基因导入胚胎期小鼠的视网膜。在我们的实验室中，该技术被用于研究调控视网膜神经节细胞的基因表达如何特异性地影响其在视交叉处的投射通路。好的，让我们开始。在进行子宫内视网膜电穿孔操作之前，充分的准备工作至关重要。有关麻醉剂的配制、器械工具的灭菌、注射用DNA溶液的制备、术后使用的抗生素-抗真菌溶液、手术区域的准备以及所需溶液的预热等详细步骤，请参见我们的书面实验方案。手术前应使用微电极拉制仪制备细尖的微量移液器。折断尖端以形成用于子宫内电穿孔的斜面尖端。首先将0.15毫升麻醉混合物经腹腔注射至处于E13.5至E14.5阶段的母鼠体内。麻醉起效需3至7分钟，期间应测试小鼠是否已完全麻醉。夹住后肢并检查动物在麻醉过程中是否无反应。剪下一小块组织，用移液器吸取五微升 DNA 溶液滴加到包埋剂上。将一根金属丝推杆弯成90度角，插入拉制的微量移液管中，用推杆吸取 DNA 溶液进入微量移液管。现在手术暴露小鼠胚胎。有关正确操作技术，请参见 JoVE 上 Wal Inus 等人的实验方案。现在我们已准备好进行电穿孔。第一步是正确调整视网膜的方向。然后我们将DNA注射到视网膜中，接着对头部进行电穿孔。好的，我们开始吧。首先，将视网膜调整至朝上，如图所示。然后使用微量移液器刺穿羊膜壁，并尽可能将DNA直接注射到视网膜内。一旦刺穿子宫壁，即按下推动器，将DNA注入视网膜，随后回抽推动器。因此，在注射DNA后，应可见绿色染料充满羊水以及视网膜。好的，现在我们已完成注射，接下来准备进行电穿孔。进行电穿孔时，我们将电穿孔电极置于胚胎两侧，其中正极电极紧邻接受电穿孔的视网膜。当准备就绪时，使用一个带负电的足部电极板，该电极板将电流传递至胚胎。你会看到气泡在带负电的电极板上形成，这表明电穿孔已成功。对所有已注射的胚胎重复此步骤。这就是将DNA电穿孔导入一个胚胎视网膜的方法。您可以根据需要对多个胚胎重复此操作。需要注意的是，进行电穿孔的胚胎数量越多，母体发生胚胎吸收的风险就越高。电穿孔后，当胚胎已返回母体时，用手指轻轻按摩将胚胎链重新推回母体。向腹腔内注入约两毫升抗生素-抗真菌混合溶液。使用止血钳和镊子缝合腹膜，从切口前部开始打双结，然后以连续简单缝合方式向切口后部延伸缝合。使用最后一个线环打结固定缝线，并剪除多余的缝线。最后，用缝合钉将切口闭合。操作时，用钝头镊子提起切口前部的皮肤。小心将皮肤与腹膜分离。接着，将缝合器的齿状部分置于皮肤周围，按压缝合器，继续向后端缝合切口，通常需要5至7个钉合钉。完成后，用酒精棉片擦拭钉合钉周围的伤口。将母鼠放回加热垫上恢复，然后将其放入新笼子中。当母鼠开始出现抽动和翻身时，通常需要15至90分钟才能苏醒，以尽量减少疼痛和不适。母鼠在苏醒时以及后续时间点均给予丁丙诺啡。如果不适持续存在且影响饮水，可在术后约2至4小时，对母鼠进行皮下注射1毫升生理盐水以防止脱水。术后24小时后，母鼠应恢复正常行为，并规律地饮水和进食。我们将在E 18.5阶段取材电穿孔后的视网膜用于分析。或者，也可以让母鼠自然分娩，并在出生后的不同时间点取材视网膜，以分析后续发育阶段的情况。在麻醉动物后，使用剪刀剪开皮下皮肤及腹膜。为暴露腹腔和子宫角，取出经电穿孔处理的胚胎，将其四肢固定于解剖皿中，腹侧朝上，切开腹部皮肤和腹膜，并剪开肋骨的侧部以暴露心脏。接下来，用灌注针穿刺左心室，并用显微剪刀剪开右心房。现在开始灌注，使PFA流动约60至90秒。若操作正确，血液应从右心房流出，胚胎将变得苍白。灌注完成后，将胚胎断头，并将头部收集至含有4%PF的15毫升锥形管中。对所有电穿孔的胚胎及所有母鼠重复此操作。在收集完所有胚胎后，通过颈椎脱位法处死母鼠。将头部在4% PFA中于4摄氏度下固定过夜，随后用PBS洗涤数天。完成PBS洗涤后，即可检测视网膜中GFP表达是否成功。首先，将头部置于解剖皿中，使视网膜朝上并浸没于PBS中，并用大头针固定。使用26½号针头去除视网膜周围的皮肤，以暴露视网膜色素上皮（RPE）。在晶状体与视网膜色素上皮（RPE）交界处穿刺腹侧视网膜。接着，将显微剪刀的一侧刀刃插入此孔，从腹侧视网膜垂直剪切至视盘。这将有助于在取出视网膜时进行定位。用一对镊子夹住腹侧切口处的视网膜色素上皮（RPE），将RPE与视网膜分离。再用另一对镊子在RPE与晶状体连接处（即RPE牢固附着的位置）将RPE从视网膜上剥离。去除RPE后，用镊子夹住晶状体，向上并向外牵拉。为去除晶状体，需小心地移除视网膜：将镊子置于视网膜下方，夹住视神经乳头以松解视网膜。最后将视网膜转移至盛有 PBS 的孔中。务必记录每份视网膜的来源。对对侧视网膜以及所有其他电穿孔胚胎重复上述步骤。使用荧光解剖显微镜扫描所有视网膜，寻找表达 GFP 阳性的视网膜，这表明该胚胎的电穿孔操作已成功，这些视网膜及其对应的脑组织可进行后续分析。离体视网膜电穿孔操作需要若干额外的 preparatory 步骤，这些步骤与胚胎内电穿孔不同。有关无血清培养基的制备与氧合、培养皿及边界实验的准备，请参见书面实验方案。在麻醉动物后，按先前所示方法打开腹腔，取出整个胚胎链并置于冰上的 D-M-E-M-F 12 中。随后应采用颈椎脱位法对母鼠实施安乐死。使用剪刀剪开子宫壁，从羊膜囊中取出胚胎，收集于D-M-E-M-F 12培养基中并置于冰上；将胚胎断头后继续保存在冰上的DMEA培养基中，躯体部分可丢弃。接下来，使用口吸移液管或活塞式移液器，向微量移液枪中加入所需量的DNA溶液。然后转移一只头部，将其置于含有PBS的解剖皿中，并用针固定，使头部背侧朝上。移至解剖显微镜下进行注射操作。好的，现在我们准备进行电穿孔。我将把DNA注入双眼视网膜的周边背部区域，然后对头部进行电穿孔。好的，现在开始。第一步是去除视网膜上方的皮肤。为此，我们将使用镊子轻轻剥离皮肤。现在我们可以看到两侧视网膜的背侧部分。接下来，我将把DNA注射到双眼视网膜色素上皮层下方。操作时，我会以接近水平的位置持握电极，从视网膜最外周的背侧穿透RPE。你应该会看到绿色染料充满视网膜下腔，并渗入PBS溶液中。好的，现在开始进行电穿孔。首先，取下固定头部的针。接下来，我们将使用电穿孔仪的电极板，注意将正极电极板置于头部的腹侧。因此，我们将头部置于电极板之间，将阳极电极板放在腹侧表面，并施加压力以保持电极板稳定。现在进行电穿孔。您可以看到电极板上以及头部表面有气泡形成。就这样。现在我们将头部转移到含有中位液的培养皿中。以上就是离体视网膜电穿孔的全部操作。根据需要对任意数量的胚胎和DNA条件重复此操作。现在我们准备开始培养视网膜。完成所有电穿孔制备步骤后，向四孔板中加入约1.5毫升充氧的SFM溶液，并将其置于冰上。每种不同的DNA溶液分别注入一个孔。接着，转移一个电穿孔后的样本。将其移至解剖皿中，使用含D-M-E-M-F 12的培养基，使视网膜朝上，置于腹侧视网膜或目标区域的对侧。使用精细镊子夹住并撕开视网膜色素上皮（RPE）形成一个小孔。以此孔为起点，将RPE从视网膜周围剥离。切勿切割或损伤眼球，否则会导致视网膜在孵育过程中塌陷。 去除RPE后，用镊子夹住视网膜基底部的视神经，将视网膜挤出，保持晶状体完整。将视网膜转移至四孔板中含氧的SFM中，并翻转过来。接着对对侧眼重复上述视网膜分离操作。对所有电穿孔的头部重复此步骤，并将视网膜在含氧的SFM中于37°C孵育40至48小时。孵育完整视网膜后，将视网膜从含氧SFM的一个孔转移至含有D-M-E-M-F 12的培养皿盖中。使用荧光解剖显微镜，选择一个视网膜并观察其表达GFP阳性的区域。接下来，使用显微手术刀和镊子解剖并弃去视网膜中非GFP阳性的部分，仅保留一块GFP阳性的视网膜组织。在解剖过程中，持续在荧光光源和普通光源之间切换观察会有所帮助。为特异性筛选GFP阳性视网膜，将GFP阳性的视网膜组织转移至含有G-M-E-M-F 12培养基的孔中。对每个 DNA 条件下的所有视网膜重复此步骤，使用新的培养皿和 D-M-E-M-F 12 培养基，将这些 GFP 阳性的视网膜组织分离成更小的视网膜外植体用于接种。使用解剖显微镜和显微解剖刀将较大的 GFP 阳性视网膜组织切成更小的外植体，外植体的长和宽应约为 200 至 300 微米。一块GFP阳性的视网膜组织应可产生约4至10块GFP阳性的视网膜外植体。将所有外植体收集至一个孔中，加入D-M-E-M-F 12培养基。对所获取的所有GFP阳性视网膜区域重复此步骤。在完成所有GFP阳性视网膜外植体的制备后，向已涂覆基质胶的培养皿中加入250微升冷的SFM培养基，并添加0.4%甲基纤维素。接下来，将四到八个GFP阳性的外植体转移至培养皿中，并用镊子轻轻将X个外植体排列成多边形，使外植体位于培养皿中心与边缘之间的中点位置。确定X个外植体的哪一侧为RGC层。可通过观察RPE结晶来判断，有时RPE结晶仍附着于外层视网膜，表明其对侧即为RGC层。RGC 一侧通常还含有一些细胞碎片，有助于将 RGC 层朝下正确放置。用镊子用力按压视网膜片的中心，使其牢固贴附在培养皿底部的玻璃盖玻片上。将所有 X 个视网膜片接种到培养皿后，转移至 37 摄氏度的培养箱中。视网膜X外植体在24小时后表现出丰富的轴突生长，可用于多种体外检测，随后用4%多聚甲醛固定30分钟。并对边界实验进行免疫染色。将4G FP阳性外植体转移至已为边界实验准备好的培养皿中。将 X 外植体沿一条直线排列，使其大致与目标底物的荧光边界对齐。在荧光解剖显微镜下，使用镊子将 EXPLAN 接种，使其距离荧光边界约 50 至 150 微米。交替使用两种荧光通道，以同时观察绿色的 explant 和红色的边界。接下来将培养皿置于37摄氏度孵育24小时，以确保视网膜神经节细胞（RGC）轴突充分生长至边界基质。随后可用4%多聚甲醛（PFA）固定外植体30分钟，再进行免疫染色。此操作在子宫内视网膜电穿孔后进行。可制备视网膜铺片以观察视网膜及半完整视觉系统中GFP阳性的RGCs。可制备视觉系统以观察视神经、视交叉和视束中GFP阳性的轴突。或者，可通过视网膜及RGC通路进行冠状冷冻切片，以观察和分析视网膜中GFP阳性的RGC胞体以及视神经、视交叉和视束中的轴突。所有视网膜轴突均通过神经丝染色进行可视化。此外，可在子宫内电穿孔以研究视网膜神经节细胞（RGC）轴突在丘脑外侧膝状体核（LGN）中的投射靶向，通过在出生后第4天至第10天（P4–P10）取仔鼠进行分析。在出生后第8天（P8），可在LGN中观察到GFP阳性轴突；通过向同侧视网膜注射CTB 594（红色通道），向对侧视网膜注射CTB 647（蓝色通道），可在离体电穿孔并移植视网膜组织后，标记完整的RGC投射通路。一部分RGC轴突呈RGFP阳性，可在低倍和高倍镜下清晰观察，分别如上图和下图所示。可通过将XS细胞接种在各种基质（图中以蓝色显示）的边缘附近，来分析GFP阳性轴突的反应。我们刚刚向您展示了如何利用胚胎期体内和离体视网膜电穿孔技术，将基因导入镜像视网膜中。尽管我们的分析重点是视交叉的轴突导向，但该技术也可为研究视网膜神经节细胞分化、树突形态以及视网膜神经节细胞电生理特性的研究人员提供帮助。在进行该操作时，重要的是要注意在注射DNA时尽量减少对视网膜的损伤，并在整个实验过程中始终用PBS保持胚胎的湿润。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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