Name: 涂层生长因子-珠放在背的前脑植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: 学习在发育中的大脑皮层外植体上制备和放置涂层生长因子珠的方法。本视频演示凝胶蓝珠和肝素丙烯酸珠两种技术，用于诱导神经组织中的空间限制性基因表达。

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作者无任何利益冲突需要披露。

生长因子包被微珠在前脑背侧外植体上的放置

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

本视频展示了两种制备和放置生长因子包被微珠的方法，这些微珠可应用于发育中大脑皮层的组织块上。这些微珠可用于在发育中的神经组织（如前脑组织块）上诱导空间受限的基因表达。文中提供了使用Affi-Gel微珠和肝素丙烯酰胺微珠的两种方法。

这是我将使用的第一种珠子，即蓝色凝胶珠，质地较软。因此，我需要在移液管末端使用一支汇集的玻璃移液管，将这些珠子放置在X标记处。我将要演示的第二种珠子是肝素丙烯酸珠。这类珠子质地较硬，我将使用一根钨针将这些珠子放置在X外植体上。这些是我首先会在本生灯上熔化的玻璃毛细管。然后将其拉拽以形成更细的尖端。我将毛细管置于火焰中部，并在管体熔化时不断滚动。我能感觉到它逐渐变软。我将把它从火焰中移出，然后进行拉伸。我将用这支带金刚石笔尖的笔在毛细管上划一条线，以便获得整齐的直线切割。然后我将用火焰抛光两端，使其整洁光滑。我将使毛细管穿过火焰，以熔光末端并缩小开口，从而使毛细管能够捕获微珠，而不是让微珠穿过毛细管。需要注意的是，不要将毛细管在火焰中停留过久。实际上只需快速通过一次即可，否则毛细管会封口。我通常会制作多个这样的毛细管，因为很多在火焰下尖端会被封住。这很难控制，所以只能多做几个。这是一个尖端被封住的例子。这是一个良好的移液操作示例。我已将250 µL的Agel磁珠加入到该Einor离心管中，接下来将用1 mL的PBS缓冲液清洗五次，以去除磁珠浸泡的Azi溶液。每次加入PBS后，我将等待约三分钟，使磁珠充分沉降，然后吸除多余的PBS，并重复此步骤四次。此时微珠尚未完全沉降，待微珠沉降后，我将吸除多余的 PBS，并重复此步骤四次。最后，加入 300 微升 PBS，开始对微珠进行操作。这是一支标准的口吸移液管，我将使用之前拉制的毛细管，将其插入约三分之一深度。首先，用 PBS 填充移液管。通常仅靠毛细作用即可充满。这是直径 30 毫米培养皿的皿盖，我在其中加入了一滴蓝色的微珠。旁边是一小滴 PBS。在此培养皿中是 5 µL 的蛋白质溶液液滴。本例中使用的是 B 和 P 四，但您也可以使用口吸管选择其他蛋白质。我将从这个蓝色圆圈中转移一颗小珠，先在PBS液滴中冲洗一次。然后用口吸管吸取小珠，放入蛋白溶液的液滴中，在室温下孵育约一小时，或在4摄氏度下孵育数小时。这里可以看到PBS中有一团小珠，我需要挑选出大小合适的小珠。如果它们太小，就会直接通过移液管的尖端被吸走。它们需要刚好停留在末端。现在可以看到，我选择了几颗珠子，其中较大的三颗和较小的三颗。我将在实验中使用较大的珠子。现在，我将把一个大珠子从PBS液滴转移到蛋白质溶液的液滴中。为此，我将轻轻将舌头从移液管口移开。这不是一种吸吮的动作，而只是施加一些负压。然后我会将其转移，并基本上把舌头重新放回管口。管头处不要吹气，而是施加一些正压，以将节拍从末端推出。现在，我已将五颗珠子放入蛋白质溶液液滴中，并将在4°C下孵育数小时，或者在室温下孵育半小时至一小时。这是培养皿，其中含有漂浮在培养基中的膜组织，以及我已解剖好的卵形结构。我将用移液器的尖端吸取一些培养基。在将微珠放置到X explan之前，我将仅用一滴培养基迅速冲洗微珠一次。这些是我将用来拾取和放置丙烯酸微珠的钨针。这是钨针，目前它已插入其针 holder 中。这些是精细的镊子。以45度角。我将使用镊子中的钨针从这池PBS中提起一个珠子，并将该珠子转移到一滴蛋白质溶液中。正如我处理琼脂糖珠一样。与处理琼脂糖珠相同，我已将这些丙烯酸珠在PBS中清洗了五次，并将一滴悬液转移至该培养板中。接下来，我将使用镊子夹持的钨针将一颗珠子转移至一滴蛋白液滴中，并像处理凝胶珠一样进行孵育。因此，这是一个提起小珠的操作。我将右手稳固地按在桌面上，同时用左手的食指在针进入液体时固定针头。我用针轻轻触碰一个小珠，然后缓慢地将其从小珠中提起。有时小珠会从针上掉落，此时只需重新取另一个即可。现在用我的左手持45度角镊子，镊尖朝下，将珠子和针头接触液体并使用。用镊子的尖端轻轻将其推离。现在我的蛋白质中有五个珠子。好的，我用右手持钨针插入珠子，左手用镊子，镊尖朝下的方向与之前将珠子推离时相同，对这四个珠子再重复一次操作，位置在x explan上。在37摄氏度下孵育，孵育时间取决于具体的检测方法。

growth-factor-coated-bead-placement-on-dorsal-forebrain-explants

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

涂层生长因子-珠放在背的前脑植

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