Name: 无有机溶剂和醋酸，蛋白质与考马斯亮蓝G - 250凝胶染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习一种无需有机溶剂和醋酸的考马斯亮蓝G-250蛋白质凝胶染色方法。该方法通过微波加热和三次水洗步骤，可在聚丙烯酰胺凝胶中于一分钟内清晰显示蛋白质条带，为生物化学研究提供安全、简便且可重复的蛋白质分析方案。

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我们感谢 Ines Racké 提供的技术支持。

第1部分：考马斯亮蓝染色液的配制
<ol>
<li>将60-80 mg考马斯亮蓝G-250溶于1升双蒸水中，搅拌2-4小时。最后，在深蓝色溶液中加入3 ml浓盐酸，继续搅拌1分钟，并将溶液避光保存以备后续使用。该溶液可保存数周至数月，染色效率不会下降。</li>
<li>浓盐酸应按照常规操作规范处理，并在通风橱中使用。最终溶液pH值约为2，因此应佩戴手套，避免与皮肤接触。</li>
</ol>
第二部分：SDS-PAGE
<ol>
<li>将适量的蛋白质样品与上样缓冲液混合，使终浓度为1×上样缓冲液。我们使用的2×上样缓冲液包含125 mM Tris/H3PO4（25°C时pH 7.5）、2 mM EDTA、4% SDS、200 mM DTT、0.02%溴酚蓝和50%甘油。也可使用其他适用于SDS-PAGE的上样缓冲液。</li>
<li>上样前将蛋白质样品加热约5分钟。同时准备凝胶电泳装置。我们使用XCell SureLock® Mini-Cell（Invitrogen）中的预制4–12% NuPAGE© Bis-Tris凝胶（Invitrogen），以MES缓冲液作为电泳缓冲液，但也可使用其他任何凝胶和电泳系统。</li>
<li>将蛋白质样品上样至凝胶，并在220 V电压下电泳运行50分钟。</li>
</ol>
第3部分：凝胶染色
<ol>
<li>拆卸凝胶盒，将凝胶放入容器中，用于后续洗涤步骤。</li>
<li>向凝胶中加入约 100 ml 双蒸水，在微波炉中加热 30 秒，加热过程中应在沸腾前停止。将装有凝胶的容器置于摇床振荡 3–5 分钟，并用新鲜水重复此洗涤步骤两次。</li>
<li>加入足量考马斯亮蓝（CBB）染色液以覆盖凝胶，并将容器在微波炉中加热 10 秒（避免沸腾）。随后将容器置于摇床上完成染色。通常在 1 分钟后即可观察到蛋白质条带，15–30 分钟后染色强度在大多数情况下已足够明显。</li>
<li>倒去染色液，加入 50–100 ml 双蒸水，在摇床上进一步脱色以降低凝胶的浅蓝色背景。如需进一步脱色，可更换为新鲜水。</li>
<li>凝胶可进行扫描、拍照或干燥处理，以便长期保存。</li>
</ol>
第4部分：代表性结果：
按照所述步骤操作后，参见图1中染色良好的凝胶。
参见图2，该凝胶在染色前未经过足够时间的洗涤，残留的SDS抑制了有效的染色。请注意，Marker泳道（*）中含有相同量的Marker蛋白。
<img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="SDS-PAGE 凝胶电泳；蛋白质分离；分子量分析；实验结果" data-altupdatedat="1787630408000"> 图 1： 蛋白质纯化样品上样后染色的代表性凝胶（*：分子量标记）。
<img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="电泳凝胶结果，蛋白质条带，分子量分析，实验室实验。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图2： 考马斯亮蓝染色前未充分洗涤的凝胶。蛋白质条带较弱（注意：标记物泳道 * 中的蛋白质量与图1相同）。

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

无利益冲突。上述方法最初由 E.M. Wondrak 在专利申请中发表（参见参考文献）。

<ul>
<li>洗涤步骤对于蛋白质的高效染色至关重要。若洗涤时间少于2分钟，或洗涤用水体积不足（&lt;50 ml），可能导致蛋白质条带呈浅蓝色，这很可能是因为凝胶中残留了较多的SDS。</li>
<li>若后续需对蛋白质进行质谱分析，则应避免使用微波炉加热步骤，同时将每步凝胶洗涤时间延长至约10分钟，并延长染色时间直至条带强度足够。加热会导致蛋白质与凝胶基质发生交联，从而可能影响质谱对蛋白质的检测。</li>
<li>除CBB G-250外，也可根据Wondrak的原始方案使用CBB R-250。我们未对这两种染料进行直接比较，因实验室已有CBB G-250的库存，且使用该染料获得了良好的结果。</li>
<li>本方案操作快速，且在洗涤与染色步骤中无需使用有毒或有害溶剂，这是采用该方法最为重要且具有说服力的优势。其灵敏度与传统的CBB染色方法及市售CBB染色液相当，在我们进行重组蛋白表达与纯化的SDS-PAGE分析中，灵敏度并未成为限制因素。</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>考马斯亮蓝 G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>也可使用其他品牌的考马斯亮蓝 G-250</td></tr><tr><td>浓盐酸</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用不含有机溶剂和乙酸的考马斯亮蓝g-250对凝胶中的蛋白质进行染色

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

在传统的考马斯亮蓝（CBB）蛋白染色方案中，SDS-PAGE 电泳后的凝胶需使用含有高浓度有毒且易燃有机溶剂（甲醇、乙醇或2-丙醇）和乙酸的溶液进行蛋白的固定、染色和脱色。为加快染色过程，常采用微波炉短时间加热染色液的方法，但这通常会导致有毒或有害的甲醇、乙醇或2-丙醇挥发，并在实验室内产生强烈的乙酸气味，出于安全考虑应避免此类情况。E.M. Wondrak 在两项专利申请（US2001046709 (A1)，US6319720 (B1)）中首次公布了一种替代性染色液配方，其中不使用任何有机溶剂或酸。该方法将 CBB 溶解于重蒸水中（每升含 60–80 mg CBB G-250），并仅添加 35 mM HCl 作为染色液中的唯一其他成分。在 SDS-PAGE 电泳后，凝胶经重蒸水充分洗涤，再进行 CBB 染色。在洗涤和染色步骤中对凝胶加热，可显著缩短处理时间，且无有毒或有害化合物挥发。加热后仅 1 分钟内即可观察到蛋白染色，15–30 分钟后染色完全，背景呈轻微蓝色，通过延长凝胶在重蒸水中的洗涤时间可完全脱除背景染色，而不影响已染色的蛋白条带。

本文介绍了一种在聚丙烯酰胺凝胶中使用考马斯亮蓝（CBB）G-250对蛋白质进行染色的简短方案，该方法无需使用有机溶剂或乙酸，而传统CBB染色步骤中通常需要这些试剂。

使用不含有机溶剂和乙酸的考马斯亮蓝G-250对凝胶中的蛋白质进行染色

在使用考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue, CBB）的经典蛋白质染色方案中，含有高浓度有毒且易燃有机溶剂的溶液……

开始此实验步骤时，将考马斯亮蓝或CBG 250溶解于1升双蒸水中，搅拌2至4小时。随后向深蓝色溶液中加入盐酸，继续搅拌1分钟，然后将溶液避光保存以备后续使用。在完成蛋白质样品制备及SDS-PAGE后，拆卸凝胶盒，将凝胶转移至容器中，用双蒸水进行三次后续洗涤步骤。第三次洗涤步骤后，将水更换为足量的考马斯亮蓝染色液，以完全覆盖盒中的凝胶。将盒子放入微波炉中加热10秒，然后将装有凝胶的盒子置于摇床上。染色完成后，一分钟后即可观察到蛋白质条带。大家好，我是来自海德堡Emberin蛋白质表达纯化中心的Amri Lawrence。今天我们将向您展示一种在氯化物凝胶中使用考马斯亮蓝G-250对蛋白质进行染色的实验方案。与传统的染色方法不同，我们的方案不使用任何有机溶剂或乙酸。我们在每次蛋白质纯化步骤后均采用本方案分析目标蛋白。现在开始操作。配制考马斯亮蓝（CBB）染色液时，将60至80毫克CBB溶于一升双蒸水中，搅拌2至4小时直至完全溶解。CBV 溶解后，将溶液转移至通风橱中。在通风橱内，向深蓝色溶液中小心加入 3 毫升浓盐酸。搅拌一分钟，此过程应佩戴手套，因为最终溶液的 pH 值为 2。溶液配制完成后，需避光保存以备后续使用。该溶液可保存数周至数月，且不会丧失其染色效率。为进行SDS-PAGE蛋白样品的制备，应取适量蛋白样品与上样缓冲液混合，使上样缓冲液的终浓度为1×，并在上样前将蛋白样品加热约5分钟。在加热样品的同时，准备凝胶电泳槽以进行电泳。我们使用预制胶，在小型电泳槽中以MES缓冲液作为运行缓冲液。然而，也可使用其他任何凝胶和电泳系统。将加热后的蛋白质样品加入凝胶中，在220伏电压下电泳50分钟。SDS凝胶电泳完成后，拆卸凝胶盒，将凝胶放入含有100毫升双蒸水的容器中。后续洗涤步骤中，将容器放入微波炉加热30秒。在沸腾发生之前应停止加热。将装有凝胶的盒子放入微波炉加热后，置于摇床上振荡三至五分钟，并用新鲜水重复此洗涤步骤两次。经过三次水洗后，加入考马斯亮蓝（CBB）染色液以覆盖盒子中的凝胶，并将盒子放入微波炉加热10秒，期间不得沸腾。随后，将含有凝胶的盒子置于摇床中，以完成染色。蛋白质条带在1分钟后即可观察到，15至30分钟后更加明显。染色效果通常已足够强。倒掉染色液，加入 50 至 100 毫升重蒸水。为了进一步减弱凝胶的浅蓝色背景，可在摇床上用新鲜水更换数次以进一步脱色。如有需要，现在可对凝胶进行扫描、拍照，或干燥以长期保存。按照本实验步骤染色后的凝胶应呈现如此外观。在此凝胶中，蛋白质条带染色清晰且明显可见，而背景几乎可以忽略。由星号标记的第一泳道含有分子量标准蛋白。相比之下，染色前未充分洗涤的凝胶会呈现如此效果：在此凝胶中，洗涤步骤时间过短，导致蛋白质条带染色不够充分。请注意，由星号标记的泳道所含的分子量标准蛋白量与之前凝胶相同，但染色效率较低。我们刚刚向您

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无有机溶剂和醋酸，蛋白质与考马斯亮蓝G - 250凝胶染色

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