从0.22微米Sterivex过滤器和氯化铯密度梯度离心法的DNA提取

大家好，我是来自实验室的 Jody，不列颠哥伦比亚大学免疫学微生物学系的 Steven Hallam。今天，我们将向您展示一种提取基因组 DNA 的程序，从海水样品中浓缩到 0.2 微米 STX 过滤器上，并通过氯化铯密度梯度离心纯化这些 DNA。我们在实验室中使用该程序来获取环境 DNA，以便我们可以研究海洋环境中的微生物群落结构、多样性和新陈代谢。

那么让我们开始吧。通过在冰上解冻开始此方案，搅拌您之前用浮游生物质浓缩的 X 过滤器，用裂解处理、缓冲并冷冻以简单。下面我们介绍处理单个过滤器的过程。

在实践中，我们建议一次处理 15 个或更少的筛选器。过滤器解冻后，开始两次孵育中的第一次。一个用于裂解细胞并去除 RNA，另一个用于分解蛋白质。

对于第一次孵育，向过滤器中加入 100 μL 溶菌酶和 20 μL RN a's a。用香水重新密封过滤器，让它在 37 摄氏度下旋转 1 小时。对于下一次孵育，向过滤器中加入 100 μL 蛋白 ace KN 100 μL 20%SDS。

使用 perfil 重新密封过滤器，并让它再旋转一到两个小时。这次是 55 度。使用 5 cc 注射器将裂解物从 Stax 过滤器转移到 15 mL的 falcon 管中。

用 1 mL 裂解缓冲液冲洗过滤器，并将冲洗液添加到 falcon 管中的裂解液中。现在您已经裂解和消化了细胞，您可以提取它们的 DNA。下一步是使用苯酚氯仿方法从裂解物中提取 DNA。

向裂解液管涡旋中加入等体积的约 3 毫升苯酚氯仿、异戊醇。要充分混合，需要 10 秒，以 2， 500 倍 G 的速度旋转试管 5 分钟。在离心过程中，苯酚氯仿裂解物混合物应分离成两层。

底部有机层包含样品中的苯酚、氯仿和蛋白质。水层通常位于顶部，由 DNA 水和其他亲水性更强的分子组成。将含有 DNA 的水层转移到新的 15 mL Falcon 试管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合物涡旋 10 秒钟。

此步骤可去除 DNA 样品中残留的苯酚。将其旋转 2 次，500 倍 G 5 分钟，或直到水层透明。将水层转移到新标记的 falcon 管中，并在 PH 值为 8 时加入 1 毫升 TE。

现在你有了你的 DNA 提取物。下一步是在 15 毫升 Amazon 超速离心管中洗涤和浓缩 DNA 样品。将您的 DNA 样品转移到 anon 的过滤室中。

Ultra tube theon 管由一个过滤器组成，该过滤器将分子保留在指定分子量或更高分子量，tate 和一根管子，用于捕获流经滤液的流体。在这种情况下，过滤器将您的 DNA 旋转保持在 3， 500 倍 G 下 10 分钟。检查以确保 Amon 过滤器中残留的液体少于 1 毫升。

如果剩余的 reten Tate 更多，请用 TE 重新填充过滤器并再次旋转。去除流经或滤液到另一个 falcon 管中，并将其保存在冰箱中，直到您在凝胶上确认最终产品，向 Amazon 过滤器中加入 2 毫升 TE 缓冲液，并以 3， 500 倍 G 离心 6 分钟。像以前一样去除滤液。

用 TE 再洗涤 DNA 两次，总共洗涤 3 次，每次保存滤液以备最后一次洗涤离心，直到 Amon 过滤器中剩余 200 至 500 微升 Tate。记下最终体积并转移到贴有标签的 1.5 ml einor 管中。将洗涤后的浓缩 DNA 制成 70 μL 等分试样，用作工作储备液。

将工作原料储存在零下 20 摄氏度。在零下 80 摄氏度下冷冻掉其余的 DNA。通过在 DNA 旁边的凝胶上用完样品来检查最终产品的 DNA 浓度和质量。

作为尺寸和强度标准的分子量标准将 0.8% AROS 凝胶加粥块溴化物设置为过夜。在前几个泳道中，使用不同分子量和浓度的条带上样分子量标准品，我们建议采用以下上样模式。在前两条泳道中，在接下来的三个泳道中加载 10 微升 1 KB 以上的分子量标准，分别装载 2 微升、5 微升和 10 微升，每微升 Lambda H 三个分子量标准品 50 纳克。

最后，每个泳道的 DNA 提取物样品上样 5 μL。在 15 伏电压下运行凝胶约 16 小时。使用 UV 凝胶成像系统对凝胶进行拍照，以确定 DNA 的分子量范围及其浓度。

将样品条带与分子量标准品的条带进行比较。优质 DNA 具有高分子量，几乎没有剪切或降解的迹象。如果 DNA 质量良好且数量充足，则通过执行氯化铯梯度来纯化 DNA。

离心 首先标记，每个样品一个离心管到每个离心管中，加入 160 毫克氯化铯和 178 微升基因组 DNA。用一小块 perfil 盖住试管，轻轻倒置试管 10 到 20 次，以便混合成分。请勿通过移液混合，否则可能会导致 DNA 剪切。

然后在试管中加入 10 微升 AUM 溴化物并再次混合。离心前确保试管平衡良好，并且试管之间的重量差异小于 1 毫克。使用镊子剪刀将试管放入超速离心机转子中。

然后关闭转子盖，将转子放在超速离心机内。关闭门后，将立即施加超速离心机门真空。在 18 摄氏度下以 100， 000 RPM 的速度运行共 20 小时。

离心完成后，使用镊子剪刀从转子中取出试管并放在架子上。将管子放在蓝光透光器上，戴上琥珀色滤光眼镜。然后打开蓝光，使用无菌的 one cc 注射器 n 针头观察您的 DNA 条带。

去除 DNA 条带，然后将其放入 1.5 mL 规格管中，以帮助回收被困在注射器死腔中的大部分 DNA。用 100 μL te 冲洗注射器，并将冲洗液加入试管中。为每个样品准备一管 100 μL te 缓冲液，以防止交叉污染。

要从 DNA 中去除 AUM 溴化物，向试管中加入等体积的水饱和丁醇。轻轻倒置试管，以 10， 000 RPM 离心 10 至 20 次，离心 1 分钟，然后丢弃顶层。再重复洗涤约 3 到 4 次，直到丁醇的颜色透明。

将 4 毫升 TE 放入 ancon 超速离心管中，加入上述 DNA 溶液，在室温下以 3， 500 倍 G 离心，直到 DNA 体积减少到约 100 至 500 微升，并丢弃流出液。向 Amazon 过滤器中加入 2 毫升 TE，以 3， 500 倍 G 离心 6 分钟。重复两次，总共洗涤 3 次，用 te 浓缩液，最终体积为 50 至 100 微升，必要时通过额外离心。

并将过滤器上的 DNA 溶液转移到新的 1.5 mL 浓度管中。向 theon 过滤器中加入 40 μL te，并沿两个滤膜上下移液以洗去任何剩余的 DNA。将此溶液加入浓缩 DNA 管中。

将 MicroCon YM 30 过滤器装置放入 MicroCon 管中，加入 200 μL 高压灭菌水，以 10， 000 RPM 的速度离心 7 分钟，对 MicroCon 进行预清洗。将 DNA 溶液添加到预洗的 MicroCon 中，以便以 5， 000 至 10， 000 倍 G 的浓度进一步浓缩 DNA 离心机，持续 1 至 3 分钟。检查过滤器上的液体量并重复离心，直到过滤器上的液体量减少到大约 50 微升。

将过滤器单元倒置在新的 MicroCon 管中，以 1000 倍 G 离心 3 分钟。浓缩溶液的理想量为 50 至 60 微升。将您的 DNA 样品转移到新的 1.5 mL 浓度管中。

在 NanoDrop 上测量 DNA 浓度并检查峰质量。干净 DNA 的吸光度图应在 260 纳米处有一个清晰的峰。将其余的 DNA 冷冻在零下 80 摄氏度。

正确完成此方案后，您应该会看到类似于图 1 的凝胶图像，提取物的实际 DNA 浓度将根据样品来源而变化。正确完成此方案后，您应该清楚地看到试管中间有一个 DNA 条带。如图 2 所示，我们刚刚向您展示了如何从 sterex 过滤器中提取基因组 DNA，并使用氯化铯密度梯度进行纯化。

执行此过程时，请务必在开始之前检查您是否拥有所有必要的试剂和消耗品。其次，至少计划三整天，以便有足够的时间仔细完成手术。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。