研究有丝分裂的显微注射技术果蝇合胞体胚胎

该程序从将胚胎收集到新鲜葡萄汁盘上 30 到 60 分钟开始。从湖笼中取出板子后，用湿刷子捡起胚胎，并将它们放在双胶带上。用半个镊子轻轻地将一个胚胎卷在胶带上，直到冠状体破裂。

拿起胚胎并将其轻轻放在盖子上。滑过一层 het 胶水。重复此作，直到您有足够的胚胎。

脱水后，胚胎就可以注射了。大家好，我是来自加州大学戴维斯分校分子与细胞生物学系 Jonathan Sculley 博士实验室的 Ingrid Bruce Musher。今天，我们将向您展示一种显微注射果蝇合胞体胚胎的程序。

我们使用该程序来研究微 ttes 和基于二尖瓣的电机在有丝分裂中的作用。例如，我们显微注射抗体或其他特异性有丝分裂蛋白的抑制剂。通过分析抑制对有丝分裂的作用，我们能够确定靶蛋白的功能。

那么让我们开始吧。为了在实验前两到三天开始准备，通过在塑料瓶的相对两侧切两个约 1 平方厘米的小孔来设置产蛋笼。用棉片填充孔，让空气流动。

将苍蝇轻敲到瓶子中，然后用葡萄汁盘盖住。使用酵母，将腿笼保持在室温下，果蝇将在实验前至少一天产卵长达 10 天。拔出注射针头，并保持在 4 摄氏度。

在实验当天，准备并加载针头。首先，将标记的微管蛋白从冰箱中取出，放在冰上 5 到 15 分钟。接下来，用 GPEM 缓冲液稀释，然后在 4 摄氏度下以 13， 000 RPM 离心 10 至 15 分钟。

最后，将 1 到 2 微升剂量加载到针头中，并将其保持在 4 摄氏度。防止针头中温度诱导聚合。在设置盖玻片之前，通过添加双胶带并将其放入 100 毫升瓶中来制作庚烷胶。

加入约 50 毫升庚烷，密封瓶子并摇晃几天。在准备胚胎之前，制作一个脱水室，胚胎将在注射前放入其中。为此，将 35 毫米培养皿的一部分放入 100 毫米培养皿中，制成一个桌子，添加烘干机，右侧，周围是无水硫酸钙，使烘干机右侧的高度不高于桌子和盖子。

要开始准备胚胎，首先，通过每小时更换一次带有酵母的葡萄汁盘从湖笼中收集它们，胚胎应在收集开始后约两小时对胚胎进行成像。要准备盖玻片，请将其放在显微镜的一侧，滑动并用胶带将四个角向下粘贴，使其不会移动。使用棉签涂抹器，在盖玻片上将一层庚烷胶排成一条线。

胶水不应是粘稠的，并应在几秒钟内干燥。如果太稠，加入更多的庚烷。最后，在盖子旁边的载玻片上贴上一条双胶带。

用湿润的刷子滑倒。小心地从葡萄汁盘中取出胚胎，并将它们放在载玻片上的双胶带上。接下来，用半个镊子将胚胎卷在双层胶带上，直到 corion 破裂。

可丽耐上轻轻滚动，使其粘附在镊子上，然后将其放在盖子上的庚烷胶上，从而拿起胚胎。使胚胎的长边平行于盖玻片的长边滑动。将 10 到 20 个胚胎排成一排。

取下盖玻片，将其放入脱水室中 3 到 8 分钟。时间取决于当地的湿度和注射量。接下来，将盖玻片放在装有真空润滑脂的金属室上。

最后，用卤烃油覆盖胚胎以避免进一步脱水。胚胎现在可以注射了。首先，找到 16 x 物镜下的胚胎。

将胚胎移开并在不移动焦平面的情况下找到针头。将指针居中并向上移动，不要沿 X 或 Y 方向移动。要打开针，请将盖玻片的边缘放入视野中，但不要放在针所在的位置。

并将指针降低到相同的焦平面。非常小心地移动盖玻片，直到它碰到针头并轻轻地将其打开。将针头向上移动。

现在让胚胎进入视野。将针头放入油中，并确保从针头上获得漂亮的液体滴剂。稳步地将胚胎移入针头中，向胚胎中注入一滴，然后将胚胎移开。

注射所有胚胎后，就可以在具有 60 或 100 倍物镜的共聚焦显微镜上进行观察了。对照胚胎应该看起来像这部电影中的胚胎。这是一个表达 GFP 微管蛋白和 RFP 组蛋白的胚胎，在转盘共聚焦显微镜上用 100 倍物镜成像。

显示的总时间为 8 分钟。极点到极点距离的曲线非常可重复，是衡量对照胚胎成功的可靠指标。它们应类似于此处显示的第 11 至 13 周期。

这部电影中展示的是另一个对照胚胎。这个表达 KLP 61 FGFP 并注射 r Domine 微管蛋白。这也是在旋转圆盘共聚焦上用 100 倍物镜成像的，总时间为 7 分钟。

这部电影是在显微注射后立即获得的，并且在电影开始时 r Domine 微管蛋白浓度的梯度清晰可见。这些胚胎可用于研究显微注射 Klp 61 F 抗体后对 Klp 61 F 的抑制作用。我们可以看到 Klp 61 FGFP 从主轴上损失。

我们刚刚向您展示了如何对果蝇切开胚胎进行显微注射。执行此程序时，请务必记住执行对照，首先练习单独注射缓冲液或芦丁，并确保有丝分裂通过细胞正常进行。一旦你所有的注射都是可靠的并且不会造成损害，你就可以注射抑制剂并研究该特定抑制剂的效果。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。